5酶与细胞固定化技术课件.ppt

一、酶的定向固定化方法 4、分子生物学方法 4.2 翻译后修饰法 当酶和载体之间允许有一个亲和素臂存在时, 可以通过翻译后修饰的蛋白质融合技术在酶上连接一个单生物素分子, 酶通过亲和素桥和载体连接 第六节 酶的定向固定化 可更换酶的定向固定化酶-载体体系 修饰的方法将钙调蛋白 连在酶的特定位点上 加入Ca 2+ 的特殊清除剂 乙二醇双( 乙-氨基乙醚) 四乙酸( EGTA) 钙调蛋白和吩噻嗪分离 钙调蛋白在Ca 2+ 存在时对吩 噻嗪具有很高的亲和特性 一、酶的定向固定化方法 4、分子生物学方法 4.3 特定位点基因突变法 如果酶中没有半胱氨酸或酶的活性位点中没有半胱氨酸, 可以在酶的特定位点上通过基因突变引入特殊半胱氨酸 如将丝氨酸变为半胱氨酸, 通过引入的半胱氨酸的一侧的巯基和载体表面的亲巯基团反应, 从而使酶和载体在特定位点进行固定化 通过特定位点基因突变法的定向固定化酶 二、酶活性位点的检测方法 为更有效地利用固定化酶系统, 了解固定化对酶活性的影响, 需更多地了解酶活性位点在固定化前后的结构变化 但是用于固定化酶的载体通常都是不透明的, 常规的检测手段无法有效检测酶的结构变化 目前, 检测酶活性位点结构的最有效最简捷的方法是电子自旋共振波谱法( electron paramagnetic resonance, EPR) 第六节 酶的定向固定化 二、酶活性位点的检测方法 在检测过程中,EPR 需要根据酶的活性位点的不同, 选择不同的自旋标记物（含自由基的基团） 木瓜蛋白酶的活性位点是巯基( -SH) , 可以用甲硫磺酸盐（methanethiosulfonate ）作为自旋标记物 4-氧-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TMPO)可以用来标记枯草杆菌的丝氨酸活性位点 EPR 方法可以十分灵敏地检测到外侧超精细极值, 2Azz（波谱两外缘峰之间的最大距离） 第六节 酶的定向固定化 附：固定化酶与生物传感器 近年来，生物传感器的发展非常迅速，它是用生物活性物质作敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具可分为: 酶传感器，微生物传感器，免疫传感器，场效应晶体管传感器 酶传感器是间接型传感器，利用酶的催化作用，在常温、常压下将各类生物分子氧化或分解，然后通过测定与反应有关物质的浓度，进而换算成相应物质的浓度。目前，国际上已研制成功的酶传感器有几十种，其中最为成熟的是葡萄糖传感器 酶膜：聚丙烯酰胺凝胶包埋葡萄糖氧化酶，厚20-50um。 酶膜与氧电极及使氧容易通过的高分子薄膜密切结合 使用时，把酶电极浸入待测样品中，葡糖糖扩散到酶膜，酶催化其反应，消耗氧，由氧电极测定氧浓度变化，最后换算出样品液中葡萄糖的浓度 二、酶的活力 固定化的单位定义为：转化底物的量/固定化酶的单位重量（单位面积）/单位时间,单位是：μmol/mg(cm2)/min 将酶进行固定化时,总有一部分酶没有与载体结合在一起,测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果 第四节 固定化酶的评价 二、酶的活力 活力回收=固定化酶总活力/被固定化游离酶总活力×100%，或称偶联效率、活力保留百分数 一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果? 第四节 固定化酶的评价 三、固定化酶的半衰期 即固定化酶的活力下降为初始活力一半所经历的时间 它是衡量固定化酶操作稳定性的关键，其测定方法与化工催化剂半衰期的测定方法相似,也可以通过长期实际操作,也可以通过较短时间的操作来推算 第四节 固定化酶的评价 第五节 固定化酶的性质 在水溶液中游离酶分子与底物同处于液相，十分邻近，而酶被固定化后，则处于载体的特定的微环境中。由于载体的物理性质对酶与底物作用的影响，酶的性质发生了变化 一、酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化，其原因可能是 ①酶的构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变 ②载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与底物或其他效应物的作用 ③底物和酶的作用受其扩散速率的限制。在个别情况下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游离酶活力高? 第五节 固定化酶的性质 二、酶稳定性提高 酶稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对pH的稳定性、对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等 第五节 固定化酶的性质 三、最适pH值的变化 酶固定化后，催化底物的最适pH值和pH活性曲线常发生变化，引起变化的因素主要有两个 载体带电性质：载体带负电荷时，会吸引反应液中的H+，致使酶附近反映区域pH比周围反应液低，须提高反应液pH；反之，降低反应液pH 第五节 固定化酶的性质 三、最适pH值的变化 产物性质：由于载体的扩散障碍，产