基因工程和基因组学课件.ppt

Western杂交: 用蛋白质电泳后转移到膜上进行分析 ③ 核酸序列测定 Sanger(1977)发明双脱氧核糖核酸链终止法:将序列反应分为A，C，G和T四管，每管中含有变性的DNA模板、DNA聚合酶、标记的引物、四种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比例的双脱氧核苷酸(如A管中，即是腺嘌呤A双脱氧核苷酸，以此类推)。在DNA合成过程中，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正在延长的DNA链中，在不同DNA链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在第三位 没有游离的羟基(-OH)，无法再连接另一个核苷酸，导致DNA链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成一系列不同大小的DNA分子。将四个反应产物并排点在聚丙烯酰胺凝胶上的四个孔中，电泳后每个孔中形成一条梯状DNA带，从底部往上阅读，即是5′到3′端的序列:CGCTCAGCTGGTGATTGTGT ④ 核酸序列分析 →测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有 什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进 一步分析，才能最后得出结论。 →同源性比较是常用的方法之一。可从核酸及蛋 白质两种水平比较基因间的同源性。首先可将 测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较， 或将得到的序列发到BLAST等DNA Data库的网址 上比较，很快就可知道测得的序列与所有的已 知序列之间的同源程度。 →另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。一个 ORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻 译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。 2、聚合酶链式反应(PCR)扩增基因 PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝。 方法:首先根据待扩增基因序列合成两个引物，分别与待扩增基因二条链的两端互补，从5′到3′的方向向待扩增基因的中间延伸。在DNA模板变性成单链后，两个引物分别与单链DNA复性，在耐热DNA聚合酶(Taq酶)及四种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成DNA新链。 PCR反应包括三个步骤： (1)变性： 94-95℃，使模板 DNA的双链变性成单链 (2)复性：50-70℃，两个引 物分别与单链DNA互补复 性 (3)延伸：72℃，引物引导、 Taq酶、4dNTPs，合成 模板DNA的互补链 →这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有 25-35个循环。一个循环完成后，待扩增 的基因扩增了一倍，新增加的基因又可作 为模板用于下一步的扩增，所以，PCR反应 中扩增的基因是成指数级增长的。因此仅 用少量的模板DNA分子，经PCR后可以得到 大量扩增基因产物。 →PCR扩增的基因经过核酸序列测定分析后， 可作为基因工程的目的基因。 →根据PCR方法及原理，现已发展衍生出很多 新方法，如RAPD, AFLP等，广泛用于基因 分子标记等研究中。 3、人工合成基因 （1）化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列 （2）将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。 （3）若将两个DNA 片段放在一起，经 SOE-PCR扩增出完整 的基因片段，或直 接测序，或克隆到 质粒上再测序后加 以利用。 五、重组DNA分子 六、将目的基因导入受体细胞（植物、 动物等），获得表达个 体—转基因个体 1、农杆菌介导法 主要用于双子叶植物 2、基因枪法 主要用于单子叶植物 3、电击法、聚乙二醇法、 花粉管通道法、显微 注射法、超声波法、 激光微束法等 七、转基因生物的鉴定 PCR Southern blotting Northern blotting Western blotting 特性（表型）鉴定 图9－18 抗除草剂转 基因植物产生的方法 1、将抗除草剂基因与 CaMV 35S启动子连接 成重组DNA分子； 2、将重组DNA分子与载 体连接； 3、将重组质粒导入土壤 农杆菌； 4、在土壤农杆菌介导下 ，部分质粒及目的基 因整合到植物染色体 上； 5、在选择培养基上选择 、培养、再生； 6、抗除草剂转基因植株 八、基因工程的应用 1、基因工程工业 生产胰岛素等 在细菌中产生胰岛素的方法 2、转基因植物 抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优 良品系或