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7. RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)与RNA分析 RT-PCR是指在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，以扩增特定的mRNA片段为目标。用于RNA分子的检测、mRNA之cDNA 克隆及测定用模板 DNA 的制备等。 RT-PCR可用于分析不同组织，或相同组织不同发育阶段mRNA表达状况。 ②去除未掺入多余引物，将两条双链DNA片段变性，退火，形成两种不同形式的异源双链分子。 ③具有3′-凹陷末端的双链分子在Taq DNA Pol.作用下生成目标突变体。 PCR反应分开做 试管1 试管2 （2）三引物诱变法 (大引物诱变法，Megaprimer method of mutagenesis) 三引物诱变法是以第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的大引物，简化反应步骤，获得突变DNA的方法。 （3）两引物PCR定向诱变法 Exsite TM PCR-Based Mutagenesis 突变反应仅需两个引物，突变位点设置于一个引物末端，使用高效的 pfu DNA Pol. 进行高温长片段DNA PCR扩增，可定向地引入碱基替代，缺失和插入定向突变。 替代突变 缺失突变 插入突变 主要参考文献 [1] Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463 [2] Maxam, A.M.W. Gilbert, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74:560 [3] Maxam, A.M., 1980, Methods Enzymol., 65:499 [4] Chen, G.Y. P.H. Seeburg，1985, DNA, 4:15 [5] 邓炜，1995， 生命的化学， 15（6）：34-36 [6] 沈孝宙，1992，生物工程进展， 12（3）：1-6 [7] 程介克，1995，生物化学与生物物理进展， 22（3）：223-227 [8] 米志勇，1996， 生物工程进展, 16（30）；54-56 复习思考题 ● PCR技术原理是什么？举例说明其在生物、农业及医学等方面的应用。 ● 有几种方法可以实现基因定点突变？简述其原理及操作程序。 不含Cu2+ 的葡萄糖培养基中，没有漆酶样活力产生。 高浓度的Cu2+有利于漆酶的合成,1mmol/L和2mmol/L CuSO4 诱导产生的漆酶活力相差不大，分别是0.1mmol/L Cu2+的8.8 和9.4 倍。 * 将漆酶的活力及其相应的mRNA分子数目取对数作图，可以看出，随着酶活增加，mRNA分子数目也相应增加。增加趋势对于LacA、LacB基本相同。 * 长久以来人们就认识到，细胞色素基因CYPl的调控也是在转录水平。还有很多的基因也是如此。 * RT-PCR反应分两步： 第一步以RNA为模板，在逆转录酶的催化下合成与RNA互补的cDNA。 第二步以cDNA为模板，像一般的PCR一样对靶序列进行扩增。 ● 在逆转录反应系统中，除了RNA样品、PCR 缓冲液和 4×dNTPS外，还包括RNA酶抑制剂(RNAsin)，单引物和逆转录酶。 一般情况下用MO-MLV，但当模板RNA的二级结构严重影响逆转录反应时，可用AMV。高温的反应有助于消除RNA的二级结构 ● 引物：逆转录反应中用的单引物一般为随机6 聚寡核苷酸(random hexamer oligonucleotides)；也可用下游引物(downstream primer)或寡聚dT(oligo dT)。 ● 常用的逆转录酶有两种： ① 禽类成髓细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶 ② 莫洛尼鼠类白血病病毒(MO-MLV)逆转录酶 ● 逆转录反应混合物在42℃下温育 30～60 min，结束后，反应管在95℃水浴中加热 5～10 min，使RNA/ cDNA双链变性，并灭活逆转录酶。AMV逆转录酶最适温度是72℃，MO-MLV 逆转录酶为37℃。 ● 作为模板的RNA分子必须是完整的，不能含有DNA、蛋白质和其它杂质。样品中如含有微量的DNA，经PCR后也会出现非特异性扩增产物。另外，如有RNA酶污染，则会使