RNAi体外沉默淋巴管内皮祖细胞VEGFR―3基因表达.docVIP

RNAi体外沉默淋巴管内皮祖细胞VEGFR―3基因表达 　　[摘要] 目的 应用聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）包裹淋巴管内皮祖细胞（lymphatic endothelial progenitor cells，LEPCs）血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）基因siRNA，体外沉默VEGFR-3基因表达，研究抑制LEPCs分化抗肿瘤淋巴管新生的作用。 方法 Ficoll法分离人脐血单个核细胞，流式细胞仪、免疫荧光分选并鉴定LEPCs。PEI包裹VEGFR-3siRNA并转染入LEPCs，流式细胞仪检测转染效率。RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白质水平VEGFR-3基因沉默效果。 结果 VEGFR-3siRNA成功转入LEPCs，转染效率30%。VEGFR-3siRNA转染组LEPCs VEGFR-3mRNA和蛋白表达均降低（P0.05）。 结论 体外经由PEI介导的siRNA能有效的抑制LEPCs VEGFR-3的表达，为以LEPCs为靶点抑制肿瘤淋巴管新生提供了实验依据。 　　[关键词] 淋巴管内皮祖细胞；VEGFR-3；聚乙烯亚胺；siRNA；淋巴管新生 　　[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）18-11-04 　　肿瘤淋巴管的新生与肿瘤转移有密切的联系，能否有效抑制肿瘤淋巴管新生成为肿瘤治疗的研究热点。2005年，Wang等[1]继Salven[2]之后提出了CD34+/CD133+/VEGFR-3+细胞为LEPCs。在趋化因子的作用下，LEPCs动员、迁移至病变组织，血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor，VEGF-C）通过VEGF-C/VEGFR-3信号途径诱导其向淋巴管内皮细胞分化，进而促使新的淋 　　巴管生成[3-4]。Religa等[5]对淋巴管炎症角膜小鼠进行辐射处理后输入骨髓源性的细胞，发现VEGFR-3+细胞出现在新生淋巴管中；Bogos等[6]检测到小细胞肺癌患者血中CD34与VEGFR-3双阳性细胞明显增多，且与癌细胞淋巴结转移呈正相关。上述结果提示，VEGFR-3在LEPCs参与的肿瘤淋巴管的新生中起重要作用[7]，如果我们靶向阻断VEGFR-3来抑制VEGF-C/VEGFR-3信号途径参与的肿瘤淋巴管新生，可达到抗肿瘤淋巴转移的目的。 　　RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的dsRNA导入细胞，特异性地降解靶基因的mRNA，从而产生相应的功能表型缺失的技术。本实验应用RNAi技术，拟将与VEGFR-3同源的siRNA转染入LEPCs，抑制其分化为淋巴管内皮细胞，从而达到抗淋巴管新生的目的，为抗肿瘤淋巴管新生提供实验依据和方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂与仪器 　　DMEM（Gibco），兔抗人VEGFR-3（Santa cruz），小鼠抗人CD133、CD34（Diagnostica），胎牛血清（四季青，杭州天杭生物科技有限公司），羊抗兔IgG FITC（Chemicon），羊抗小鼠IgG PE（Chemicon），羊抗兔IgG TRITC（Jackson），Trizol（Invitrogen），cDNA反转录试剂盒（Fermentas），Ladder DNA、蛋白质marker（Bio-rad），蛋白提取试剂盒（pierce），PEI（25kDa，Sigma Aldrich）。 　　流式细胞仪（FACS Calibur，FACSAria，BD）；PCR仪（9600型，PE）；转膜仪和蛋白电泳仪（Bio-rad）；恒温培养箱（Heraeu）；Olympus荧光显微镜、相差倒置显微镜（Nikon）。 　　1.2 单个核细胞的分离 　　取50～60mL足月正常分娩胎儿脐血，加入103 IU肝素。按Ficoll液密度梯度离心法[8]分离单个核细胞。将静置后的上部血液等量稀释后加于Ficoll液面上，Ficoll液与稀释血液的比例约为1∶2，离心（360g，25min）。将含有单个核细胞的液段移至另一离心管，PBS混悬后离心（250g，12min），收集细胞。 　　1.3 LEPCs的分选 　　用PBS（含1%BSA）清洗细胞，PBS混悬细胞，调整细胞密度1×107个/mL，加兔抗人VEGFR-3（1∶100），4℃孵育55min。用PBS洗3次，加1∶100 TRITC标记的羊抗兔IgG，4℃孵育30min。PBS清洗后，用DMEM（含2.5%FBS）重悬细胞[9]，FACS Aria流式细胞仪分