第五基因的分离与鉴定.ppt

用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图 方法: mRNA的翻译 : 用体外蛋白质合成检测mRNAs 。（麦胚无细胞转译体系或兔网织细胞裂解物转译体系） 通过凝胶电泳分析mRNAs : 用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳 cDNA 文库- 检测mRNA的完整性 确定 mRNA 没被降解 克隆特殊的 mRNAs 克隆一个特殊的基因比建立完整的cDNA文库更有用 凝胶分离: 通过琼脂糖凝胶电泳回收 mRNAs（根据mRNA的大小） 富集: 通过杂交来实现 cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第一链的合成 G 5’PPP’5 G AAAAAAAAOH3’ 引物 退火 mRNA 逆转录酶 dNTP G 5’PPP’5 G AAAAAAAAOH3’ G 5’PPP’5 G AAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTp5’ TTTTTTTTTp5’ 自身引导法：获得的双链cDNA 5’ 端会有几对碱基缺失 cDNA第二链的合成 G 5’PPP’5 G AAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTp5’ NaOH 煮沸 TTTTTTTTTp5’ OH3’ Klenow dNTPs TTTTTTTTTp5’ AAAAAAAAOH3’ S1 AAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTp5’ 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 cDNA第二链的合成 G 5’PPP’5 G AAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTp5’ RNaseH DNApol dNTP TTTTTTTTTp5’ 5’ TTTTTTTTTp5’ S1 T4DNAligase TTTTTTTTTp5’ AAAAAAAAOH3’ 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 cDNA第二链的合成 核酸末端转移酶 G 5’PPP’5 G AAAAAOH3’ TTTTTTp5’ TdT dCTP G 5’PPP’5 G AAAAACCCCCCOH3’ CCCCCC 3’OH TTTTTp5’ NaOH TTTTTp5’ CCCCCC 3’OH 退火 TTTTTp5’ CCCCCC 3’OH 5P’GGGGGG klenow dNTPs TTTTTp5’ CCCCCC 3’OH 5P’GGGGGG AAAAAOH3’ 对cDNA 末端的处理 平末端的片断需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能进行克隆 步骤 : 移去突出的 3’-ends(strand-special nuclease) 填充缺失 3’ 核苷酸 (klenow fragment of DNA polyI and 4 dNTPs) 衔接物和平末端的连接(T4 DNA ligase) 限制性内切酶的消化 (E.coRI ) 与载体的连接 任何一个含有E.coRI 酶切位点的载体都可以用来克隆cDNA 步骤 : 载体末端脱磷酸（碱性磷酸酶） 用T4 DNA 连接酶连接 载体 和 cDNA (plasmid or l phage vector) 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等 cDNA法分离目的基因的基本程序 完备分离程序 cDNA法分离目的基因的基本程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆。如血红蛋白基因等 特异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能 cDNA法分离目的基因的基本程序 差异分离程序 差异分离程序 多瘤病毒感染的FR3T3细胞 正常的FR3T3细胞 提取mRNA 总mRNA 共价交联 提取mRNA 总mRNA 合成cDNA cDNA 合成第二链 单链cDNA 克隆 原位杂交 病毒诱导表达的cDNA克隆 上柱 双链cDNA 1. 以mRNA为材料； （一些RNA病毒，不经过DNA中间体，对其研 究，cDNA是唯一可行的方法） 2. 与基因文库的筛选比较，更简单易行； 3. 由于每一个cDNA克隆都含有一种