β―七叶皂苷钠对体外退变椎间盘细胞抗炎作用及机制研究.docVIP

β―七叶皂苷钠对体外退变椎间盘细胞抗炎作用及机制研究 　　[摘要] 目的 探讨β-七叶皂苷钠对体外退变椎间盘细胞抗炎作用及机制。 方法 采用体外培养的退变椎间盘细胞，免疫印迹法检测0、5、10、20 μmol/L β-七叶皂苷钠作用24 h后，炎性因子白介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）以及相关调控蛋白细胞核因子-κB（NF-κB）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达变化。 结果 β-七叶皂苷钠可显著抑制退变椎间盘细胞炎性因子IL-1、TNF-α表达，退变椎间盘细胞中调控炎性因子表达的蛋白NF-κB在β-七叶皂苷钠作用后表达显著降低，而TGF-β1表达水平显著升高。 结论 β-七叶皂苷钠可通过抑制NF-κB途径以及上调TGF-β1表达，显著抑制退变椎间盘细胞的炎性反应。 　　[关键词] β-七叶皂苷钠；退变椎间盘细胞；炎性因子 　　[中图分类号] R681.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（c）-0016-03 　　椎间盘发生退行性变时，髓核组织暴露可导致机体免疫炎性反应，导致退变的椎间盘组织中有大量免疫炎性细胞因子表达[1]。研究表明，椎间盘退变组织中有免疫细胞的浸润和多种炎症因子的高表达[2]，炎症因子在椎间盘退变的发生发展过程中发挥极其重要的作用[2-3]。植物提取物β-七叶皂苷钠具有抗炎、抗渗出及消肿胀等作用，本实验对β-七叶皂苷钠体外抑制退变椎间盘细胞炎性反应的效果进行了研究，并深入探讨了相关机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　β-七叶皂苷钠购于中国药品生物制品检定所；胎牛血清、DMEM培养基购于Invitrogen公司；白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）以及相关调控蛋白细胞核因子-κB（NF-κB）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗均购自武汉博士德公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠IgG二抗为Promega公司产品；增强化学发光试剂盒（ECL）购于Millipore公司；PI染色试剂盒、Bradford法蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥公司。 　　1.2 椎间盘细胞分离培养 　　椎间盘组织样本取自内蒙古医科大学第二附属医院住院病例，男、女各3例，年龄26～38岁，病程5～16个月，MR检查显示，突出物明显压迫神经根。标本均在术中切取，其中，L4～5 2例，L5～S1 4例，椎间盘突出组织中均含不同比例的髓核和纤维环。椎间盘组织标本在无菌条件下反复冲洗数次，去除表面血细胞，将纤维环和髓核剪成约1 mm3大小组织块，胰蛋白酶（0.25%）和Ⅱ型胶原酶（0.2%）交替消化，D-Hanks液冲洗，离心，加入适量的DMEM培养液，计数后将细胞以（1～2）×105浓度接种于培养板，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。 　　1.3 免疫印迹法检测蛋白表达 　　分别用溶剂（对照组）和5、10、20 μmol/L浓度β-七叶皂苷钠（药物组）处理椎间盘细胞24 h后，免疫印迹法检测IL-1、TNF-α以及NF-κB、TGF-β1蛋白表达水平，GAPDH作为内参蛋白，按照如下步骤进行操作：处理后收集细胞，4℃预冷磷酸缓冲液（PBS）液洗3次，加入细胞蛋白提取液（50 mmol/L This-HCl pH=7.4，1% Triton X-100， 0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L EDTA），4℃、12 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，上样量为10 μL/well，之后将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转到PVDF膜上，封闭，不同浓度稀释一抗IL-1（1∶500）、TNF-α（1∶500）、NF-κB（1∶1000）、TGF-β1（1∶1000）及GAPDH（1∶2500），孵育，4℃过夜，HRP标记抗鼠/兔IgG二抗常温孵育1 h，之后经ECL孵育，暗室内X光胶片成像，采用GelPro软件进行图像分析。每组重复6次，结果取算数平均数。 　　1.4 统计学方法 　　采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，以P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 β-七叶皂苷钠对退变椎间盘细胞炎性因子IL-1、TNF-α表达的影响 　　浓度为5、10、20 μmol/L的β-七叶皂苷钠作用24 h后，椎间盘细胞内炎性因子IL-1、TNF-α表达水平明显下降，均显著低于对照组，差异有高度统计学院意义（均P 0.01），且不同剂量β-七叶皂苷钠作用后椎间盘细胞内炎性因子IL-1、TNF-α表达呈现明显的剂量-效应关系