人ERCC1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建.docVIP

人ERCC1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建 　　【摘要】 目的：构建人切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementation 1，ERCC1）启动子荧光素酶报告基因质粒。方法：以人基因组DNA为模板，扩增ERCC1启动子，将其重组到荧光素酶报告基因载体pGL4 Basic中，测序验证构建的质粒中包含ERCC1启动子序列。结果：测序结果正确，质粒pGL4-ERCC1-P1构建成功。结论：人ERCC1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功，可以用于后续基因表达调控的研究。 　　【关键词】 报告基因； ERCC1； 启动子 　　中图分类号 R 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）14-0144-02 　　Construction of the Human ERCC1 Luciferase Reporter Plasmid Promoter/SONG Ying，GU Yi-xue，QIU Qin-wei，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2014，12（14）：144-145 　　【Abstract】 Objective：To construct a human excision repair cross complementation 1（ERCC1） promoter luciferase reporter plasmid.Method：The ERCC1 promoter from human genomic DNA was amplified by PCR，and was inserted into the pGL4 Basic vector.The amplified DNA sequence was confirmed by sequencing.Result：DNA sequencing verified the successful construction of the plasmid pGL4-ERCC1-P1.Conclusion：The human ERCC1 promoter luciferase reporter gene vector is successfully constructed，which can be use for further study on gene expression regulation. 　　【Key words】 ERCC1； Luciferase reporter gene； Promoter 　　First-author’s address：Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China 　　切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementation 1，ERCC1）是核苷酸外切修复酶家族重要成员之一，同时也是核苷酸酶切修复系统和链内交联修复DNA途径中的关键基因[1]。有研究表明，该基因与肺癌的铂类化疗耐受相关，但是目前尚未有人报道ERCC1的转录调控机制[2]。本文拟构建人ERCC1启动子荧光素酶报告基因，对进一步研究ERCC1基因的表达调控和揭示肺癌的铂类耐药机制提供有力的工具和手段。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　质粒小提试剂盒（Plasmid mini kit）和琼脂糖凝胶回收试剂盒（Gel Extraction kit）购自OMEGA；限制性核酸内切酶BglⅡ、KpnⅠ、T4 DNA连接酶均购自Fementas；1 Kb DNA maker和Premix TaqTM（LATaqTM Version 2.0）均购自TAKARA；DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA kit）购自TIANGEN；大肠杆菌感受态Top10和质粒pGL4 Basic为本室保存。 　　1.2 引物的合成与基因扩增 　　根据Gen Bank上人ERCC1基因第一个外显子第一个碱基为+1，选取上游-3000 bp序列，作为ERCC1的启动子序列，用引物设计软件Primer 5.0 设计引物。为了便于回收扩增片段，在基因序列5’端分别加上BglⅡ和KpnⅠ酶切位点（下划线处）。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。Forward Primer： 5’-CCGggtaccGGGTCTGATTGAGATTTTGGGTC-3’，Reverse Primer： 5’- CCGagatctCCTTGTAAAACGTTGCCTTCACT-3’。提取人肺癌细胞