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一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用 关键词： 巨噬细胞 肺泡 一氧化氮合酶 肿瘤 　　活化的巨噬细胞在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用［1］。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺M NOS活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。 　　1　材料和方法 　　　肺M的制备及培养　体质量20～25 g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1 ml,共15次。将回收的灌洗液以1 500 r/min离心10 min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液配成 1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5% CO2培养2 h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量的干扰素γ,继续培养24 h。 　　　肿瘤细胞培养上清液的收集　将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞 P815 以 5×105个/ml的密度培养在RPMI 1640培养液中,置37℃,5% CO2培养箱培养48 h, 2 500 r/min离心20 min,取上清液,置-20℃保存待用。 　　　iNOS活性测定　用Smith薄层层析法［2］测定上清液培养标本中瓜氨酸 的生成量，以此反映iNOS的活性。 　　　NO测定　10 mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10 mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545 nm时的光密度值,作曲线,并得出直线回归方程式［3］。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂，50 μl/孔，置37℃，5% CO2培养箱培养 4 h，再加入含10% P815上清液的营养液 100 μl/孔，置37℃,5％CO2培养72 h。每孔加二甲基亚砜 100 μl,混匀静置20 min,在PG-3022酶联仪上用570 nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。 　　　统计学处理　所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t检验，各指标进行直线相关分析。 　　2　结果 　　　不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响　不同剂量的 INFγ与活化的肺M共同培养24 h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高,且呈明显的剂量依赖关系。 图1　INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响 　　fig 1　The effect of INFγ on NO production and 　　activity of iNOS by macrophages 　　●: NO; ▲: iNOS 　　　INFγ对肺M NOS活性的影响　不同剂量INFγ作用于肺M后，肺M iNOS活性随INFγ剂量的增加而升高,与INFγ的剂量有明显的相关性。 　　　L-NMMA对肺M肿瘤杀伤活性的影响　活化的肺M与P815单独作用时，其培养上清液中NO的浓度为 μmol/L，而预先加入 L-NMMA再培养的上清液中NO浓度为 μmol/L，两组之间有显著性差异；未加L-NMMA组肺M对P815细胞生长的抑制率为%，预先加入 L-NMMA组为%，较前者明显降低［两组D值分别为±和±，P＜］。 　　3　讨论 　　NO由L-精氨酸经NOS作用而生成。NOS主要有两种同工酶：结构型和诱导型基团作用，形成铁-亚硝基复合物，从而引起顺乌头酸酶和线粒体呼吸链上的复合物Ⅰ与复合物Ⅱ中的 Fe-S辅基的纯化与降解，从而引起细胞毒性［8］。肿瘤细胞内铁的大量丧失，破坏了许多代谢酶的活性，因此可阻断肿瘤靶细胞的能量代谢和 DNA复制。同时活化的M产生的NO可通过促进细胞内 cGMP的升高来诱导并促进细胞凋亡的发生，从而抑制肿瘤细胞生长或引起肿瘤细胞的凋亡［9］。 　　综上所述，肺M内iNOS及其代谢产物NO与肺M肿瘤杀伤作用之间存在着明显的关系，通过各种手段提高肺M NO的产生，可能为肺癌的治疗提供一条新的途径。 参考文献 　　1　Cui S, Reichner JS, Mateo RB, et al. Activated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide- dependent or -independent mechanisms［J］. Cancer Res，1994,54 ：2462 　　2　Sm