HBVcccDNA及其意义课件.ppt

感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 感染科 2006-08-15 汤正明 * 2006-08-15 * He等建立了实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法。他们将Taqman MGB探针设计在负链缺刻的下游，与负链互补结合。对cccDNA，在上游引物的引导下，Taq酶到达Taqman MGB探针所结合的位点，利用其5’→3’外切活性将探针切断，3’端的淬灭基团失去对5’端的发光基团的抑制作用，从而产生荧光信号。每扩增一个cccDNA分子，就会产生一个荧光信号，PCR仪可对产生的信号进行实时监测，根据荧光信号的强弱对cccDNA进行定量。对rcDNA，由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺刻，故不能使Taqman MGB探针被Taq酶切断产生荧光信号。该方法的特异性比选择性PCR进一步提高，可以消除高rcDNA背景可能产生的非特异性扩增。该方法的检测低限可达100个拷贝，灵敏度比目前应用的任何一种其它方法都高。所有检测在2小时内可完成。 感染科 2006-08-15 * 还有其他一些更为敏感的检测方法，如Shao等报告的两步法对cccDNA进行实时荧光定量。其设计与He等的方法有异曲同工之处，即都是利用rcDNA与cccDNA分子结构上是否完整来有效地将二者区分开来，实现对cccDNA的特异性检测。 感染科 2006-08-15 * 该方法在荧光探针位置的选择上更符合荧光PCR的要求，即探针越靠近引物效果越好，这样检测到的荧光信号质量和实时扩增曲线形状可能更佳，而在He等的方法中探针与上游引物点之间的距离则至少需要在230个碱基以上。但是，该方法存在与套式PCR类似的缺点，即需要分两步操作，单链延伸反应管开盖后极有可能造成产物污染。 感染科 五、慢性乙肝患者cccDNA检测的意义 第一，cccDNA可作为评价抗乙肝病毒药物的新指标。 目前临床上评价干扰素、核苷类似物这些抗乙肝病毒药物时存在一个很大的问题。 即其评价指标主要是患者肝功能的改善与否、血清乙肝病毒DNA水平的变化以及肝组织的病理学改变等。 2006-08-15 * 感染科 2006-08-15 * 诚然，这些指标对临床医师判断患者病情而言非常重要和实用，也是临床医师选用抗乙肝病毒药物时的依据。 然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后乙肝病毒是否会重新复制活跃导致乙肝复发，则缺乏客观而有效的指标。 感染科 2006-08-15 * 开展肝细胞内乙肝病毒cccDNA的动态定量监测可以部分解决这个问题。 治疗前后肝细胞内乙肝病毒cccDNA含量的变化应该纳入到抗乙肝病毒药物评价的指标体系中来，从一定意义上说，只有能够彻底清除乙肝病毒cccDNA的药物，才能算是真正“有效”的抗病毒药物。 感染科 2006-08-15 * 第二，检测乙肝病毒cccDNA可作为评价乙肝病毒是否能感染肝外组织的客观指标之一。乙肝病毒不仅仅是一种嗜肝病毒，一些肝外组织中也可检测到乙肝病毒DNA，如肾脏、胰腺以及外周血单个核细胞(PBMC)等。 早就有人发现乙肝病毒可以感染白细胞,而这种免疫细胞的感染似乎有利于病毒逃避免疫反应，从而导致机体清除乙肝病毒的能力下降。关于PBMC能否被乙肝