碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1.pptVIP

 酶的提取纯化过程中应该注意哪些问题？如何评价酶的提取与纯化成功与否？ 测定酶的比活性有何意义？ 测定蛋白质含量的方法 * 操作步骤见上。 * 结果记录与分析 * 实验内容：酶的提取及比活性测定 加入有机溶剂计算公式如上 磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性， 37℃保温15分钟产生1mg酚者为1个酶活性单位。 2. 蛋白质含量测定 测定样品的比活性必须测定包括：每毫升样品中的酶活性单位数，每毫升样品中的蛋白质毫克数。 目 录 目 录 综合性实验 酶学实验 酶的提取及比活性测定 酶的本质是蛋白质，其提纯方法常用分离纯化蛋白质的方法 原料要求：新鲜、酶含量丰富 来源：体液（直接提取）、组织（先破碎） 匀浆+低渗 方法：盐析、有机溶剂、层析、电泳 先粗后细、多法配合 保护酶的活性 pH 酶的最适pH不一定是酶的最稳定pH 温度 一般低温，个别例外（如丙酮酸羟化酶0℃不稳定，26 ℃稳定），防止反复冻融。 氧化 防止必需基团中游离巯基的氧化（β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇） 重金属离子 （EDTA乙二胺四乙酸） 蛋白酶污染 细胞破碎时溶酶体释放大量酶类（低温、蛋白酶抑制剂） 介质的极性和离子强度 根据酶的性质选择介质（蔗糖、甘油可提高疏水环境；KCl、NaCl、NH4Cl等提供高离子强度介质） 检测酶提取纯化的指标 酶的纯度：