COX―2抑制剂对食管癌ECa―109细胞的放射增敏作用.docVIP

COX―2抑制剂对食管癌ECa―109细胞的放射增敏作用 　　【摘要】 目的 探讨选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂NS-398作用于食管癌细胞株ECa-109，观察其放射增敏作用，并对其可能增敏机制进行初步探讨。方法 应用MTT法检测NS-398对细胞的生长抑制率；克隆形成实验分析放射增敏效应，流式细胞术（FCM）定量检测细胞凋亡；实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2及BaxmRNA表达。结果 NS-398可显著增强ECa-109细胞的放射敏感性，对细胞的生长抑制作用呈时间与剂量依赖性；Ns-398显著增加放射诱导的细胞凋亡，上调BaxmRNA表达，而Bcl-2表达无明显变化（P0.05）。结论 NS-398可增强食管癌细胞ECa-109的放射敏感性，其机制可能与上调Bax表达，上升Bax/Bcl-2比例，激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡相关。 　　【关键词】 环氧合酶-2抑制剂；辐射增敏；细胞凋亡；食管癌细胞 　　食管癌是一种常见的消化道肿瘤，放射治疗为其主要治疗手段之一，目前放疗效果尚不尽人意。放射增敏剂作为提高放疗效果的一个重要途径，也已成为研究热点。新近发现诱导型环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂在体内外都有放射增敏作用[1-2]，然其确切增敏机制尚未明确。本研究探讨COX-2抑制剂NS-398对食管癌细胞系ECa-109的放射敏感性影响，并初步研究其可能增敏机制。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；胎牛血清为杭州四季青产品；MTT、DMSO、NS-398均为Sigma产品；NS-398溶于DMSO中，现配现用。Trizol为Invitrogen公司产品；RevertAid first strand cDNA Synthesis试剂盒为MBI产品；PCR试剂盒购自大连宝生物公司；引物为上海伯亚公司合成；Annexin V-FITC Kit购自Immunotech Company（France）。Caspase-3Colorimetric Assay Kit系BioVision（USA）产品；PMD18-T Vector购自TaKaRa Company。Epics-XLⅡ型流式细胞仪（Beckman-Coulter Company，USA）；食管癌细胞株ECa-109为浙江大学医学院附属邵逸夫医院中心实验室保存。 　　1.2 细胞培养 将ECa-109细胞接种于含双抗的10%胎牛血清RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。实验选取对数生长期细胞。 　　1.3 MTT实验检测药物毒性及适宜浓度 将细胞以105/孔接种96孔板，24h后开始药物实验，NS-398设0、10、50、100μmol/L4个浓度组，每个浓度组各取12、24、48、72h四个时间点检测，设不接种细胞的空白对照和只含1‰DMSO的对照，每浓度每时间点重复4孔。采用MTT法在酶联免疫检测仪上测定570nm处吸光度值（A），细胞存活率（%）=实验孔A值/对照孔A值×100%。 　　1.4 克隆形成实验分析放射增敏效应 实验分组：①单照组；②联合组：照射+NS-398处理。根据不同照射剂量接种适量细胞于培养皿，24h贴壁，联合组更换含25μmol/L的NS-398培养液，两组继续培养24h，室温下分别接受0、2、4、6、8、10Gy的6MVX-ray照射，照射后联合组更换无药培养液，两组继续培养14天。甲醇固定，姬姆萨染色，计数50个细胞克隆数。经单纯用药校正后计算存活分数，实验结果3次平均值。以多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线，计算参数D0、Dq及SER（放射增敏比）值。 　　1.5 FCM检测细胞凋亡 实验分4组：①未处理组；②单药组：含25μmol/LNS-398培养液培养24h；③单照组：6MVX线照射8Gy，SAD为100cm，机架角为180°，加1.5cm等效组织填充物，剂量率1Gy/min；④联合组：照射+药物。各组取处理后细胞1×106个，按AnnexinV-FITCkit说明书步骤，加PI染液5μL，Annexin V-FITC染液5μL，室温、避光培育30min，加入900μL Binding Buffer，上机检测，由FS和SS设门选定细胞，利用Coulter公司的System II TM软件处理结果，每次实验均设阴性和阳性对照，并设3复孔。 　　1.6 实时荧光定量PCR检测Bcl-2、BaxmRNA表达 PCR引物用primer5.0软件设计，并经GenBank校对，核实。Bcl-2引物：正义链5′-GCCTTCTTTGAGTTCGG-3′，反义链5′-GGGTGATG