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iMDCs干预重症肌无力小鼠模型的初步研究 　　【摘 要】目的：观察输注未成熟树突状细胞（iMDCs）干预重症肌无力小鼠模型（EAMG）的发病及Syk蛋白水平变化。方法：建立小鼠重症肌无力发病模型，采用iMDCs干预实验。健康雄性小鼠50只，随机分为模型组（A）20只、干预组（B）20只和对照组（C）10只。实验从初次免疫起至第90天终止，实验结束后行EAMG临床评估并进行脾脏和淋巴结Syk蛋白表达水平比较。结果：临床评估：A组发病率高于B组；实验终止时两组临床评分分别为1.69±1.12 ；0.35±0.67（P0.01）；C组小鼠无发病。A组小鼠的脾脏和淋巴结Syk蛋白表达水平较C组小鼠升高（P0.01），B组较A组相比有所下降（P0.05），但高于C组（P0.05）。结论：输注iMDCs能够减轻重症肌无力小鼠临床症状及Syk蛋白表达，提示iMDCs干预能够调节EAMG免疫紊乱。 　　【关键词】实验性自身免疫性重症肌无力模型；未成熟树突状细胞；Syk蛋白 　　【中图分类号】R746.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）09―0036―01 　　重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）传递过程出现障碍的自身免疫性疾病。至今，医学界对它的发病机制尚未完全阐明。目前研究认为MG是由乙酰胆碱受体抗体（AChRAb）破坏突触后膜运动终板上的乙酰胆碱受体（AChR），导致AChR 大量丢失、出现肌无力症状的自身免疫性疾病。由抗体介导的体液免疫和T 细胞介导的细胞免疫异常被认为是其主要的发病机制之一[1]。研究表明，未成熟骨髓来源的树突状细胞（immature bone marrow dendritic cells， iMDCs）具有调节免疫的功能，能够诱导免疫抑制[2]。本实验通过静脉注射iMDCs干预EAMG小鼠模型，观察模型组与干预组的临床评分及免疫组织中Syk蛋白表达水平的变化，初步评价iMDCs的疗效。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　健康雄性Lewis小鼠50只，体重150-160 g。室温20±2℃条件进行下饲养，饲养过程中水、食任意摄取。随机分为3组：模型组（A） 20只、干预组（B） 20只和对照组（C）10只，各组生长环境、周龄、生长状况等无统计学差别（P0.05）。 　　1.2实验方法 　　1.2.1建立实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia graves，EAMG）实验动物模型[3]。纯化后的Torpedo乙酰胆碱受体（AchR）与CFA乳化混合（20?g AchR，100?l CFA，100?l PBS ）。模型组（A）和干预组（B）小鼠进行各足垫皮下注射50?l免疫，每只在实验第0d，30d，60d共进行3次，建立EAMG动物模型。对照组小鼠在实验第0d，30d，60d共进行3次等量PBS足垫皮下注射。 　　1.2.2 iMDCs培养与注射 参照文献[4，5]的方法培养iMDCs。根据预实验结果，第6天收集iMDCs，应用荧光标记抗体（CD11c，CD40，CD86， MHC-Ⅱ）及同型对照抗体标记iMDCs表型，并用流式细胞仪及CellQuest软件对其进行检测和分析。实验前用PBS洗涤3次，以PBS调整浓度为5×105 个/ml。干预组（B）于实验第3d，33d，63d自小鼠尾静脉输注iMDCs 1ml，对照组（C） 于实验第3d，33d，63d自小鼠尾静脉输注等量PBS。 　　1.3 评估方法 　　1.3.1 临床评估 　　实验结束后第90d进行EAMG临床评估，按Lennon临床患病标准评分[6]：0分，没有任何肌无力现象。l级：撕咬无力，四肢力量较差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且易疲劳。2级：明显无力，休息时身体呈隆起姿势，头尾下垂，大腿外展，前肢趾弯曲，动作笨拙，行走不稳。3级：严重无力表现，无撕咬动作，肌肉震颤，呼吸困难，濒死或死亡。并通过注射新斯的明50?l （0.015mg/ml）获得短暂改善验证动物重症肌无力。 　　1.3.2 Syk蛋白检测 　　非受体型酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）蛋白表达水平检测[3，7，8]： 在实验第90天后以断颈法处死小鼠，夹取小鼠腹股沟、腋下淋巴结及脾脏，采用Western blot法进行Syk蛋白表达水平检测。 　　1.4 统计学处理 　　所有数据均采用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料都以均数±标准差（ ）表示，组间比较采用方差分析，多样本间每两个样本的比较用q检验。P0.05表明差异具