Pim―1在人宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义.docVIP

Pim―1在人宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义 　　【摘要】 目的：研究Pim-1基因及其蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达水平，探讨其与宫颈鳞癌临床特性之间的关系。方法：采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量方法和免疫组化学法，检测46例宫颈鳞癌组织和10例正常宫颈组织标本中Pim-1基因及蛋白的表达情况。结果：宫颈鳞癌组织中Pim-1基因与蛋白的表达水平明显高于宫颈正常组织（P0.05）；Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关（P0.05）。结论：原癌基因Pim-1及其蛋白在宫颈鳞癌组织中过度表达，可能与宫颈鳞癌的发生、发展有关。 　　【关键词】 宫颈鳞癌； 反转录-聚合酶链反应； 免疫组化； Pim-1基因 　　Pim-1基因最早在莫洛尼小鼠白血病病毒诱导的T-细胞淋巴瘤中被发现的[1]，其编码的Pim-1蛋白激酶具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，参与调节细胞增殖、分化与凋亡等。已有大量的研究表明Pim-1在人类多种肿瘤组织中高表达。但关于Pim-1在宫颈癌组织中的表达情况研究报道甚少。本研究应用RT-PCR方法和免疫组化学法分别检测了Pim-1基因和其蛋白在宫颈鳞癌中的表达情况，初步探讨了Pim-1基因与宫颈鳞癌发生、发展的关系，并且为以后深入研究提供了相关理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本来源 所有标本均来自郑州大学第一附属医院妇产科2009-2011年手术治疗且术后经病理科证实为宫颈鳞癌患者46例（恶性组）、多发性子宫平滑肌瘤患者10例（正常组），所选患者术前均未进行放疗和化疗。取所有入选病例术中切除的新鲜宫颈组织标本，均分作两份，一份立即放入液氮中保存，用于做RT-PCR实验；另一份用福尔马林溶液固定、石蜡包埋，用于做免疫组化实验。 　　1.2 试剂 RT-PCR所用试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，引物是由北京赛百盛生物技术有限公司合成：Pim-1上游引物序列为5 CGATGGGACCCGAGTGTA 3，下游引物序列为5 TGGAGGTGGATCTCAGCAGT 3，扩增片段为312 bp；内参照β-actin的上游引物序列为5 CTGGGACGACATGGAGAAAA 3，下游引物序列为5 AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3，扩增片段为564 bp。SP试剂盒和DAB显色剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人单克隆抗体Pim-1购于美国EPITOMICS公司。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 RT-PCR 取约100 mg宫颈组织，按Trizol提取试剂盒说明提取各组织总的RNA，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度，反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。取逆转录产物2 ?L，按PCR试剂盒说明进行。Pim-1引物扩增条件为：94 ℃预变性2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃总延伸6 min。取上述扩增产物5 ?L与缓冲液混合后加入2%琼脂糖凝胶的加样孔中，进行电泳。EB染色，用紫外线投射仪观察电泳条带，拍照并记录，用D-140图像记录分析系统进行分析，得出Pim-1 mRNA相对表达量。以正常宫颈组织作为对照。 　　1.3.2 免疫组化 采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法检测Pim-1蛋白的表达，具体操作按试剂盒说明书进行。染色结果判定：Pim-1在光镜下进行分析，随机选择5个高倍视野共计数200个细胞，在排除非特异性染色的前提下，胞浆/胞核出现淡黄色至黄棕色或棕褐色为阳性染色。计分方法：（1）染色程度：无着色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，黄棕或棕褐色计3分；（2）阳性细胞百分率≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，≥76%计4分。评判标准（A×B）≤1为阴性表达，1为阳性表达。 　　1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0软件学软件对数据进行处理，计量资料应用Kruskal-Wallis检验，计数资料采用 字2检验，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 不同宫颈组织中Pim-1基因及蛋白的表达 Pim-1基因在宫颈鳞癌组织中的表达水平为（1.361±0.122），明显高于正常宫颈组织的（0.023±0.002），差异具有统计学意义（P0.05）。Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中阳性表达例数为35例（76.1%），高于正常宫颈组织的3例（30.0%），差异有统计学意义（字2=6.026，P=0.014）。 　　2.2 宫颈鳞癌中Pim-1蛋白的表达与临床特征的关系 Pim-1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切