生物钟基因Per2在结直肠癌诊断中的应用价值探讨.docVIP

生物钟基因Per2在结直肠癌诊断中的应用价值探讨 　　【摘 要】目的：具体探讨生物钟基因Per2在结直肠癌诊断中的应用价值。方法：选择2009年4月至2013年1月间32例于我院行结直肠癌根治术患者的手术切除标本作为样本，同期选择32例正常肠道组织作为对照样本，采用免疫组织化学方法检测生物钟基因Per2蛋白的表达。结果：切片镜下显示肿瘤中较配对的正常肠道组织中Per2蛋白的表达呈明显增高，在细胞核及细胞浆中均见强阳性。随Dukes分期的增强，Per2表达阳性表达率及阳性强度呈递增趋势，Per2中度及强阳性表达与Dukes分期呈正相关（P0.05）。结论：结直肠肿瘤存在生长凋亡的昼夜节律性，生物钟基因Per2可能参与了肿瘤的发生发展及侵袭转移。 　　【关键词】生物钟基因；结直肠癌；Per2蛋白；免疫组织化学方法；Dukes分期 　　【中图分类号】R735 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）11―0148―01 　　众所周知，人类、老鼠和其它许多植物、动物都拥有一个内在的生物钟，使得生理、行为和生化的周期节奏与一天24小时的昼夜循环相一致。当前研究显示，生物的昼夜节律失调是肿瘤发生和进展的内在因素之一。恶性肿瘤的研究目前发展到从分子水平和蛋白水平寻找防治新手段【1-2】。众多数据显示，生物钟基因per2基因的过表达可以促进肿瘤细胞的凋亡，促使实验动物体内的肿瘤缩小，其过表达还可以对细胞的放射性损伤起到修复作用，这一发现对肿瘤的临床治疗具有重要的指导意义【3-4-5】。本文为此具体综述与临床分析了生物钟基因Per2在肿瘤学的研究概述与应用价值，现分析如下： 　　1 资料与方法 　　1.1 研究对象 　　选择2009年4月至2012年1月间32例于我院行结直肠癌根治术患者的手术切除标本作为样本。入选标准：所有病例术前均未行相关手术治疗或放化疗。所有病例经术后病理证实为结直肠腺癌；患者同意留取标本进行研究。其中男性17例，女性15例；年龄分布于40-79岁，平均61.25±3.21岁，中位年龄61岁；病理组成：隆起型腺癌II级16例，溃疡型腺癌II级10例，浸润型腺癌II级6例； Dukes分期：A期10例，B期12例，C期10例。同期选择32例正常肠道组织作为对照。 　　1.2 标本采集 　　在手术切除标本自大体切断所有血供后15分钟内，自肿瘤侵犯处肠壁取材作为实验组，自远离肿瘤近标本切缘处肠壁取材作为对照组，所取标本立即投入液氮中暂存，后放入-70℃冰箱保存，用作组织RNA的抽提。全部标本经10%中性福尔马林固定，石蜡切片用作免疫组织化学检验。 　　1.3 免疫组织化学方法检测 　　免疫组织化学检测采用Envision两步法，DAB显色；石蜡切片经二甲苯脱蜡三次，经100%、95%、80%的酒精蒸馏水水化，蒸馏水充分洗净；0.3%H202甲醇液室温20分钟，TBS（0.05M，PH7.6，下同）洗5分钟×3次；枸橼酸缓冲液（O.01M，PH6.O）高温预热5分钟，将脱腊水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中火加热5分钟×2次，低火保温5分钟后取出微波盒，冷却至室温取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用TBS洗5分钟X3次。5%小牛血清蛋白3TC孵育20分钟。滴加一抗（兔抗人Per2 1：50），37℃温箱1小时，TBS洗5分钟X3次。选择Envision抗兔工作液，37℃温箱1小时，TBS洗5分钟X3次。10mlTBS液中加入4mgDAB，充分混匀，滴加0.5mlH202，室温下显色5-lO分钟，显微镜下控制着色浓度。常规苏木素复染细胞核1分钟，脱水，透明，封片。显微镜观察。 　　1.4 阳性结果评分标准 　　显微镜下观察，在清晰的背景上细胞质呈现棕色为阳性，同时采用分数判断法，0分为阴性（-），1-4分为弱阳性（+），5-8分为中度阳性（++），9-12分为强阳性（+++）【6】。 　　1.5 统计学处理 　　应用SPSS18.0统计软件进行分析。P0.05表示差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 图像分析 　　Per2表达情况免疫组织化学结果显示，32例人结直肠癌组织与相配对的正常肠道组织相比较，Per2蛋白表达量明显不同，全部切片均显示肿瘤中较配对的正常肠道组织中Per2蛋白的表达呈明显增高，在细胞核及细胞浆中均见强阳性。具体见图1与图2。 　　2.2 分数判断分析 　　经过具体判断，在正常组织中Per2蛋白均呈阴性表达或者弱性表达；而结直肠癌组织中，中度及强阳性表达率高达93.8%（30/32），两组对比差异明显（PO.05）。具体见表1。 　　3 讨论 　　生物钟“振荡器”（相当于钟表的擒纵器）就是位于细胞核内的“生物钟