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脂多糖诱导膀胱癌细胞释放HMGB1及其机制研究 　　[摘要] 目的 研究脂多糖（LPS）对膀胱癌细胞高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放的诱导作用，并探讨其可能的机制。 方法 采用人膀胱癌细胞株T24，观察100 μg/L LPS诱导不同时间对培养上清液中HMGB1含量和细胞HMGB1 mRNA 表达水平的变化，及不同浓度的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路抑制剂LY294002对HMGB1释放的作用。分别使用酶联免疫吸附试验、荧光定量PCR法检测HMGB1含量和HMGB1 mRNA表达水平。 结果 培养上清液中HMGB1含量和细胞HMGB1 mRNA 表达水平均于LPS诱导12 h后升高，并随诱导时间延长而进一步升高。LY294002对LPS诱导HMGB1释放有不完全的抑制作用。 结论 LPS诱导膀胱癌细胞释放HMGB1，其机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。 　　[关键词] 高迁移率族蛋白B1；膀胱移行细胞癌；内毒素；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B 　　[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（a）-0007-03 　　膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其绝大多数为移行细胞癌。膀胱癌目前以手术治疗为主，但五年生存率低。慢性感染和炎症被认为是肿瘤发生、发展极为重要的原因之一。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）作为一种核内DNA结合蛋白，可以分泌到胞外并介导炎性反应，是一种重要的晚期促炎症因子[1]。研究显示，HMGB1的高表达与肿瘤细胞增殖、浸润、转移以及患者预后等关系密切[2]。最近研究表明，HMGB1在膀胱癌组织中高表达，且与肿瘤的分级、分期及患者预后相关[3-4]。脂多糖（LPS）可以诱导单核细胞、巨噬细胞等主动释放HMGB1到胞外[5-6]。LPS对膀胱癌细胞诱导HMGB1释放作用尚未见研究报道，本研究旨在观察LPS对膀胱癌细胞释放HMGB1的影响，并探讨其相关信号通路机制，为阐明疾病治疗新途径提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人膀胱移行细胞癌细胞株T24购自中国科学院细胞库；RPMI-1640培养液、OPTI-MEM I培养液购自美国Gibco公司；LPS、LY294002购自美国Sigma公司，HMGB1 ELISA 试剂盒购自日本Shino-Test公司；Trizol、逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。HMGB1、GAPDH引物由日本TaKaRa公司合成。 　　1.2 细胞培养 　　使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，将人膀胱癌细胞株T24置于5%CO2培养箱中培养，至细胞达到对数生长期时，换用无血清OPTI-MEM I培养液。首先经预实验筛选出LPS的合适浓度和LY294002的不同浓度及检测培养上清液中HMGB1含量的最佳时间。选择100 μg/L LPS为作用浓度。只加OPTI-MEM I培养液组为对照组，加含100 μg/L LPS 培养液组为LPS诱导组，并于LPS诱导6、12、18、24 h检测培养上清液中HMGB1浓度和细胞HMGB1 mRNA表达水平。加100 μg/L LPS及不同浓度LY294002组为LY294002干预组，LY294002预处理时于100 μg/L LPS诱导前1 h加入培养细胞，干预24 h后，收集细胞培养液，然后离心取上清液检测HMGB1含量。每组实验均重复3次。 　　1.3 HMGB1浓度测定 　　采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中HMGB1浓度。按试剂盒说明书进行实验。 　　1.4 HMGB1 mRNA测定 　　根据Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。HMGB1上游引物：TTGTCGGGAGGAGCATAA，下游引物：GGGCGATACTCAGAGCAGAA，扩增产物长度为267 bp。内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG，下游引物：GGAAGATGGTGATGGGATT，扩增产物长度为208 bp。PCR循环参数为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火/延伸20 s，循环40次。以目的基因HMGB1和内参GAPDH的Ct值之差（△Ct）作为评价目的基因 mRNA相对表达水平的指标。目的基因 mRNA的相对量按公式：目的基因=2-△△Ct计算。 　　1.5 统计学方法 　　采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分