CHAP1-酶工程基础课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 两者的关系可用中间中间产物学说来解释。 * * * * * * * * * 基础：中间产物学说 * * * 三、酶活力的测定方法 终止法：在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间后终止反应，然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，从而计算出酶活性。终止反应的方法有加热、强酸、强碱、三氯乙酸、SDS、乙醇等。 连续反应法：不需要取样终止反应，而是基于反应过程光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度等的变化，用仪器跟踪监测反应，记录结果，算出酶活力。 三、酶活力的测定方法 1.分光光度法：利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。 优点：简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。 2.荧光法：主要是根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定。 3.酶联测定法：许多酶促反应中，产物出现或底物的消失并不会引起光吸收的变化。在这种情况下要测定催化此反应的酶的活力，可将其与第二个具有特殊吸收光变化的酶反应相偶联。 酶与底物的中间产物学说 一、米氏方程 (米曼氏公式) S+E ES P+E 底物浓度与酶反应速度关系的数学表达式： 第五节 酶动力学和抑制作用 米氏常数 1、米氏常数Km ：当v=1/2 Vmax 时的底物浓度 Km=[S] Km值：是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是mol/L，与底物浓度的单位一样。 米氏常数Km k2 + k3 k1 第五节 酶动力学和抑制作用 Km= k1 k3 E+S ES E+P k2 k1k2k3：速率常数 E：酶 S：底物 ES：酶-底物复合物 P：产物 2、关于米氏常数Km的几点说明 （1） Km是ES复合物稳定性的量度 （2） 对许多酶而言，k2比k3大得多，这时的Km就变成了酶对底物的亲和力的量度，因为它的值分别依赖于ES的生成或解离（即k1、k2的值）。 高Km值→弱底物结合（k2＞k1） 低Km值→强底物结合（k2＜k1） 2、关于米氏常数Km的几点说明 （3）不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数，只与酶的性质有关，而与其浓度无关。 （4）Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定得到的，不同条件下具有不同的Km值。 （5）同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。 1、抑制作用与抑制剂 2、抑制作用的类型和特点 3、一些重要的抑制剂 4、酶抑制剂的应用（P222） 二、酶的抑制作用 1、抑制作用与抑制剂 抑制作用：由于酶分子上的某些必需基团化学性质的改变，而引起酶活力下降或丧失，但并不使酶蛋白变性的现象称为抑制作用。 （抑制作用不同于失活作用） 抑制剂（inhibitor） ：能够引起抑制作用的物质，可以是正常细胞代谢物，也可以是外源物质。 （抑制剂不同于变性剂） 2、抑制作用的类型 （1）不可逆抑制作用 （2）可逆抑制作用  竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 专一性不可逆抑制作用 非专一性不可逆抑制作用 （1）不可逆抑制作用(irreversible inhibition) 定义：抑制剂与酶的活性中心的功能基团共价结合而抑制酶的活性,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。 专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂只作用于某种酶活性部位的必需基团或一类酶。 非专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂作用于酶分子上一类或几类不同的基团或作用于几类不同的酶。 如：酰化剂酸酐和磺酰氯等可使酶蛋白的-OH、SH、NH2等发生酰化而使酶失活。 不可逆抑制作用恢复酶活性的方法 例如： 有机磷杀虫剂 乙酰胆碱脂酶（Ser-OH） 不可逆抑制 解磷定 （2）可逆抑制作用(reversible inhibition) 定义：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失，抑制剂可以通过透析等物理方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。