蔗糖酶的催化反应.pptVIP

蔗糖酶的催化反应及活力测定 一.实验目的 1.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色 定糖的原理和方法； 2.学习掌握酶的活力测定及其计算 方法。 二.实验原理 蔗糖酶活力测定的原理 1.蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖 （非还原糖） （还原糖） 2.酶活力=酶活力单位/ml=U/ml 3.酶活力单位：在本实验条件下，每min释放1mg 还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位 1U=1mg/min 二.实验原理 3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理 1. DNS试剂+ D-葡萄糖 氨基化合物 （还原糖） （棕红色） 2.在一定范围内还原糖的量与棕红色物质的颜色强度成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定吸光度，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的量 三、试剂和器材 （一）试剂： 1. 蔗糖酶溶液 2. 5%的蔗糖溶液 3. DNS （3,5二硝基水杨酸试剂) 4. 1mol/L的 NaOH溶液 5. 2mg/ml的葡萄糖标准液 （二）器材： 1．移液管、吸耳球 2．试管、血糖管（或刻度试管） 3．秒表 4．沸水浴 5．恒温水浴 6．分光光度计 、比色杯、镜头纸、滤纸 四、操作步骤 1、 DNS比色定糖法工作曲线的制作 ①取6支血糖管编号0—5，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（0.2%）、蒸馏水、DNS试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：①一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅；②用秒表记时），取出后立即放入装冷水的大烧杯中冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的A值。 ②以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出工作曲线。 制作工作曲线的注意事项 1.分光光度计的使用： 测样时,光吸收值A应在0.100—0.700之间，并小于标准曲线的最大值，否则，缩小or加大样品的稀释倍数，重测！ 2.比色杯的使用： 向杯中加样液时，按浓度从低到高的顺序加，注意加样到比色杯的2/3处； 如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许檫）；再用镜头纸向一个方向檫至透明； 倒出液体后，一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置在滤纸上吸干； 任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上； 自备废液杯（盛废液及废纸块用） 2.蔗糖酶的活力测定 取酶液2ml,按2倍稀释，分装两支试管，每支试管2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（做参比），另一支做测定管； 把两支试管和5%的蔗糖溶液都放在35℃水浴中预热恒温；上述两试管中分别加入2ml 5%的蔗糖液，并准确计算时间，3分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应。 从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即放入装冷水的大烧杯中冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测吸光度 在葡萄糖标准曲线上找到所测定吸光度值对应的葡萄糖含量，计算酶活力 五、结果及数据处理 * * 蔗糖酶 强碱性溶液中 沸水浴中 3.0 0 2.0 4.0 5 3.0 0.4 1.6 3.2 4 3.0 0.8 1.2 2.4 3 3.0 1.2 0.8 1.6 2 3.0 1.6 0.4 0.8 1 3.0 2.0 0 0 0 光吸收值 A540 3，5-二硝基水杨酸试剂（ml） 去离子水 （ml） 葡萄糖标准液（ml） 含糖量 （mg） 试号