酶联免疫斑点试验在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的应用价值.docVIP

酶联免疫斑点试验在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的应用价值 　　【摘 要】目的：探讨酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）（T-SPOT.TB）在快速诊断结核杆菌感染性疾病中的临床应用价值。方法：利用ELISPOT检测对结核菌特异抗原刺激反应，分泌γ-干扰素的效应T淋巴细胞数量方法，对72例结核杆菌感染性疾病组和20例健康体检者组的外周血作能分泌结核特异的γ-干扰素的T淋巴细胞测定，与结核菌纯蛋白衍生物试验（ PPD） 、结核抗体检查结果进行比较分析。结果：T-SPOT.TB敏感性为 91.7%，较PPD试验36.1%、抗结核抗体55.6%和PPD试验+抗结核抗体29.2%均明显增高，P值均0.05），而较之结核抗体的特异性 60.0%，在统计学上也具有显著差异（P 0. 01）。T-SPOT.TB的准确率为 92.4%，较PPD试验46.7%、抗结核抗体56.5%和PPD试验+抗结核抗体42.4%均明显增高，P值均 0. 01，在统计学上具有显著差异。结论：酶联免疫斑点试验验检测结核敏感性强、准确率高，是诊断结核感染的有效手段。 　　【关键词】结核分枝杆菌；T-SPOT.TB；PPD试验 抗结核抗体 　　结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，是目前严重威胁人类健康的三大感染性疾病之一， 快速诊断和治疗是结核病控制的关键问题，但是，结核病的诊断仍然存在严重问题。传统的结核病检测方法如痰涂片染色法、培养法、免疫学方法和分子生物学方法等等虽然很多，但是这些方法存在敏感性较低、特异性较差、操作复杂，检测周期长等问题。酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunos pot， ELISPOT） （T-SPOT.TB）是由Czerkinsky等[1]于1983年根据酶联免疫吸附试验（ ELISA）建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学技术，并由La-lvani等[2]首先将其应用于结核病的快速诊断，为结核病的快速诊断提供了一条新途径。本研究旨在以T-SPOT.TB检测其外周血结核特异抗原T淋巴细胞的数量，探讨该技术在结核病快速诊断中的应用价值。 　　1 材料与方法 　　1.1病例资料 结核组： 72 例均为 2012 年 3 月～2013年3 月本院住院的结核患者，结核病诊断依据2001年中华医学会结核病学分会制定的结核病的诊断标准执行，具有较高的可信性和可比性。男 44 例，女 28 例，年龄 16 ～78（ 39.6 ± 16.5.） 岁。其中肺结核 54 例，结核性胸膜炎 14 例，骨结核2例，结核性脑膜炎 1 例，肠结核 1例，所有病例均为临床确诊病例。健康对照组： 22 名本院体检中心体检健康人员，男 14 例，女 6 例，年龄12 ～ 46（ 28.5 ± 12. 0） 岁，均无结核病史和任何临床症状，经X 线检查确定无异常。 　　1.2 T-SPOT.TB 取3～4mL外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离、提纯外周血单个核细胞（PB-MC），调节细胞浓度至2.0×106/L。取一预包被IFN-C捕获单克隆抗体的微孔板，每个测试样本需要微孔板3孔：阴性对照孔内加入完全细胞培养液50uL，阳性对照孔内加入阳性对照PHA50uL；在测试孔内分别加入CFP10-ESAT6融合蛋白50uL。分别在上述各孔内加100uL含有2×105个PBMC的悬液，将微量板置于37℃含5%CO2孵箱中孵育20h；弃上清液，用200uL×PBS洗板4次，每孔加入50uL1∶60稀释的IFN-γ检测抗体，37℃孵育2h；洗板后，每孔加入50uL1：1 000稀释的链亲合素-碱性磷酸酶，室温孵育2h；洗板后，每孔加入50uL新鲜配制的BICP/NBT底物，显色15min；可见板底显示紫色斑点，用蒸馏水洗板中止反应。每1个点代表1个分泌IFN-γ的T细胞，应用CTL公司酶联斑点分析仪计数着色的斑点。当阴性对照孔点数6，检测孔点数减去阴性对照孔点数?8，可判断所检测标本为阳性；如果阴性对照孔点数?6，检测孔点数为阴性对照孔2倍，可判断所检测标本为阳性。 　　1.3 PPD试验：于左前臂皮内注射标准PPD 0.1ml（含5个结核菌素单位）。72h查验反应结果，记录硬结平均直径。按PPD皮试结果分级：PPD（-）：硬结5mm；PPD（+）：硬结5～9mm；PPD（++）：硬结10～19mm；PPD强阳性（+ + +）：硬结≥20mm或出现明显水泡、坏死。 　　1.4 抗结核抗体检测 取外周不抗凝血2～3mL，1～2h后3 000r/min离心15min，取上清液用于抗结核抗体检测。联合检测3个抗结核抗体所用抗原分别为阿拉伯甘露聚糖、结核分枝杆菌活动期产生的38×103u蛋白及16×103u蛋白。严格按试剂盒提