阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导的研究.docVIP

阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导的研究 　　【摘要】 目的：探讨不同浓度阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导增殖和成骨诱导分化能力的影响。方法：取生长状态良好的第四代细胞，分为实验组（不同浓度的阿仑膦酸钠，A-F组）、空白对照组（L-DMEM，G组）和阳性对照组（地塞米松，H组）各自诱导成骨分化。观察细胞形态，放射免疫法检测各组hBMSCs骨钙素的分泌能力，实时荧光定量PCR检测各组细胞培养液中Runx2和Osx mRNA的表达情况，并检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶（LPL）mRNA的表达情况。结果：hBMSCs诱导分化至第7天时，A-F组大部分细胞仍呈长梭形，G组部分细胞开始出现形态学改变；各组细胞培养基中骨钙素均随诱导分化时间推移而增多；各组细胞表达Osx和Runx2 mRNA也随诱导分化时间推移而增多；hBMSCs经诱导分化21 d时，A-F组细胞Osx和Runx2 mRNA表达量进一步增加，E组和F组超过半数细胞阳性表达，高于其他阿伦磷酸钠工作液诱导组；在阴性对照组，始终未见有细胞形态学改变、骨钙素表达和Osx和Runx2 mRNA表达。结论：ALN能促进hBMSCs增殖和骨向分化，1×10-6mol/L为其诱导分化的合适浓度。 　　【关键词】 阿仑膦酸钠； 人骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 骨向分化 　　doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.14.075 　　阿仑膦酸钠可以抑制各种情况下的骨量丢失，包括原发性骨质疏松和肢体制动、双侧卵巢切除术后等各种原因造成的继发性骨质疏松[1-2]，同时可以提高骨生物力学水平。研究发现在组织水平， 阿仑膦酸钠能够降低骨转换，形成钙正平衡，使骨量增加，但其分子机制目前还不十分清楚，一般认为其作用的靶细胞为成熟的破骨细胞[3]，也有人认为阿仑膦酸钠在一定浓度下可影响成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞成熟分化[4-5]，另外不排除在诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化方面起作用。目前，阿伦磷酸钠对成骨细胞的增殖有不同的研究结果，多数学者认为适宜浓度下阿伦磷酸钠促进成骨细胞的增殖，甚至可能促进成骨细胞增殖或成熟分。但其浓度相关性影响细胞增殖的机制有待进一步研究。笔者就不同浓度的阿仑膦酸钠对人骨髓间充质干细胞体外骨向诱导进行实验，发现了体外培养所需的最适浓度，现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂、仪器和人骨髓间充质干细胞 所需试剂：L-DMEM（DMEM-低糖培养基， Gibco公司，美国）、胎牛血清（fetal bovin serum，FBS，杭州四季青）、0.25%胰酶/EDTA（杭州）、人淋巴细胞分离液（密度1.077 g/ml，天津市TBD生物中心）、磷酸盐缓冲盐水（PBS，武汉博士德）、青霉素/链霉素双抗（杭州）、CD31、CD45、CD29、CD44小鼠抗人流式抗体（abcam）、FITC标记大鼠抗小鼠二抗（武汉博士德）、IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）、胰岛素和吲哚美辛均购自Sigma公司；油红O购自Amresco公司；离心管、培养皿和96孔培养板（Corning， 美国）、倒置相差显微镜（德国Leica公司）、C02培养箱（美国Thermo Formo公司）、离心机（Beckman Coulter）、Beckman Coulter流式细胞仪器、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、恒温水箱和气浴恒温振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限）。 　　本实验所有标本均取自因骨性关节炎需行全髋关节置换或膝关节表面置换术的患者。同时本研究需排除患有其他骨关节疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、骨肿瘤、甲状腺和甲状旁腺疾病以及肾功能不全的患者。 　　1.2 诱导分化步骤 取融合至80%～90%第4代人骨髓间充质干细胞，进行分孔成骨诱导分化。每个96孔板分为8个组（A-H组，每组12孔），每个孔加入不同浓度的阿伦磷酸钠工作液（购于石家庄制药集团有限公司），浓度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L（分别为A-F组），同时设立空白对照组和阳性对照组，分别加入等体积不含阿伦磷酸钠工作液的L-DMEM作为阴性对照组（G组），和加入含浓度为1×10-8 mol/L的地塞米松诱导液作为阳性对照组（H组）。将3个96孔板置于37 ℃、5%CO2的孵育箱内培养。3个96孔板细胞分别进行成骨诱导时间为7、14和21 d，诱导分化期间每2天换液1次。 　　1.3 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化的鉴定 人骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨分化第7、14和21天时，分别进行放射免疫法对细胞培养液中骨钙素分泌能力进行检测和采用实时