第20章基因治疗.pptVIP

（四）三链DNA 三链DNA在基因治疗中的意义 寡聚脱氧核苷酸（ODN）以DNA双螺旋分子的专一性序列为靶子，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止转录 技术关键 TFO 的设计与合成 专一性 稳定性 摄取与分布 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 3.RNA干扰的应用前景 RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。 （三）核酶(ribozyme)用于基因治疗 天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。 锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图 三个双螺旋区 13个核苷酸残基保守序列 剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生 （N代表任意核苷酸，H代表A,U或C） 1. 核酶的设计 核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。 （1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。 在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。 核酶的作用机制 2.核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。 核酶导入细胞方法 1、外源导入法：可以通过化学合成；也可以采用体外转录方法 2、内源导入法：利用表达载体在细胞内转录产生核酶分子。 四、治疗基因的受控表达 Regulated Expression of Therapeutic Gene 时间: 治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。 空间: 表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。 1.控制治疗的基因在患者需要实施治疗时才表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态； 2.根据不同疾病的治疗要求，控制治疗基因持续表达的时间跨度。 是指为了提高基因治疗的专一性和安全性，严格限制治疗基因只在靶细胞中表达，避免治疗基因指导合成的蛋白质干扰非靶细胞的正常生活，产生毒副作用。 要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。 ?使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 ?使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件 （一）基因内部的调节机制 1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。 不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因的特异性表达，从而起到治疗作用。 2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件 某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。 甲胎蛋白(AFP)基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFP基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。 癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺