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常见分子操作基本步骤 1、总RNA的提取（BIOZOL法提取） 1 2、植物种胚中RNA的提取（CTAB - LiCl 提取法） 3 3、两步法RT-PCR 4 4、琼脂糖核酸电泳 7 5、胶回收纯化DNA （AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒） 9 6、连接（T载体连接） 11 7、连接（T4 酶连） 12 8、感受态细胞的制备（大肠杆菌） 13 9、质粒DNA的提取（碱裂解法） 15 10、酶切 16 11、Ni柱纯化His-tag蛋白质 17 11.1 非变性条件下抽提His-Tag蛋白质 17 11.2 变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质 21 12、NTA树脂的再生 23 1、总RNA的提取（BIOZOL法提取） 从植物组织分离RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNase的污染。但RNase活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性Rnase外，环境中也存在大量Rnase。外源性的Rnase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的Rnase也会造成污染。这些外源性的Rnase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的Rnase。 因此在提取RNA时，应尽量创造一个无Rnase的环境，包括去除外源性Rnase污染和抑制内源性Rnase活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性Rnase，通过Rnase的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性Rnase（注：BIOZOL溶液包含异硫氰酸胍和苯酚，实验时请格外小心）。 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80 °C冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。 步骤： （1）提取植物组织RNA前，应先将研磨用的器具洗净；研磨前用液氮将所有器具及待用的灭菌EP管预冷，避免样品潮解； （2）用液氮将上述组织研磨后迅速转入预冷的EP管中，每50～100 mg组织用1 ml BIOZOL试剂对组织进行裂解，立即混匀，在室温15~30 °C下放置5分钟； （3）在上述EP管中，按照每1 ml BIOZOL加0.2 ml氯仿的量（1/5 体积）加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15 °C～30 °C）放置2～3分钟后，12000g（2 °C～8 °C）离心15分钟； （4）取上层水相置于新EP管中，加入等体积异丙醇（每1 ml BIOZOL约加0.6 ml异丙醇），-20 °C放置10~30分钟，12000g（2 °C～8 °C）离心10分钟； （5）弃上清，加1 ml 75 %乙醇进行洗涤，轻轻混合，7500g（2 °C～8 °C）离心5分钟，弃上清； （6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥； （7）用Rnase-free water溶解RNA沉淀。 2、植物种胚中RNA的提取（CTAB - LiCl 提取法） 植物总RNA提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术，而某些植物组织中富含多糖、脂质及酚类物质，往往不利于RNA的分离和纯化，因此能否有效地去除多糖和脂质是提取高质量植物RNA成败的关键。CTAB-LiCl 提取法可在不用液氮的室温下有效地排除剥取种胚中大量带有的多糖和本身脂质的干扰，并进一步满足RT-PCR等实验的需要，适用于富含多糖和脂质的植物组织RNA提取。 步骤： （1）在1. 5 ml EP管中加入700 μL的RNA提取液（2 % CTAB (w/v)，内含2 %～5 % PVP (w/v)，100 mmol/L Tris - HCl（pH8 . 0），25 mmol/L EDTA（pH8 . 0）和2.0 mol/L NaCl，灭菌，使用前加入β-巯基乙醇使其终浓度为2 %～5 % (v/v) ），并置于65 °C水浴锅中温育0.5 h以上； （2）将灭菌镊子剥取的水稻种胚直接加入RNA提取液，灭菌玻璃棒捣碎，涡旋混合，继续在65 °C温育10 min ； （3）加入等体积的氯仿+异戊醇，涡旋混匀后4 °C 10000g离心10 min，用灭菌枪头小心剔除漂浮的脂肪层，吸取上清； （4）重复上述步骤，并在合并的上清中加入1/4体积的10 mol/L LiCl 溶液并混匀，4 °C条件下过夜，使RNA沉淀； （5）次日，于4 °C，10000 rpm 离心20 min，弃上清； （6）用Rnase-free water溶解RNA； （7）再加入0.1体积3 mol/L的NaAc和2.5体积95