05第5章_基因与载体连接研讨.pptVIP

* * 第五章 基因与载体连接 一、黏性末端与平末端的连接 二、其他连接方法 一、黏性末端与平末端的连接 一）黏性末端DNA分子间的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。 1. 两段DNA的连接 依靠粘性末端 依靠粘性末端 2. DNA片断与载体的连接 nick ligase 3. 4 . 粘性末端的更换 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 二) 平末端（blunt end）的连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 1. 直接连接 T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5’ 3’ -OH -P P- HO- 5’ 3’ 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。 （1）同聚物加尾 法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ①原理： 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 ②加尾—碱基互补 ④缺点： ③优点： 能把任何片段连接起来 不能把插入片段再切下来。 非酶切位点 5‘突出的末端 　 外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加p