中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件.pptVIP

项目一 从菠萝中提取菠萝蛋白酶 一、实验目的1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶；2、掌握对目的蛋白酶质量的检验；3、学习酶比活力的计算； 二、实验基本原理 菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。 三、实验材料和试剂1、实验材料  新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 ?柠檬酸钠 ?维生素c ?单宁 ?0.1%EDTA溶液 ?1.5%氯化钠溶液 ?1%酪蛋白溶液 ?1mol/L氢氧化钠溶液 ?0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0） ?激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用） 四、实验器材和仪器 1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管； 五、实验操作方法法和步骤 （一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： （二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量 1、标准曲线的制作 按下表操作 根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图 （三）菠萝蛋白酶活力的测定 1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液； 2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂； 3、另取5支试管，分别对应标号?、?、?、?、?，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂； 4、将10支试管置于37℃水浴； 5、然后按下表操作 6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min;7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，于室温放置30min;8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度9、测定结果如下 （四）数据的处理 1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg 2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U 3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg 4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0 （五）结果讨论 从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有： 1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响； 2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出； 3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理； 4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低； 5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。 * * 微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙 将菠萝切碎 加柠檬酸钠，榨汁 菠萝汁 纱布过滤 澄清液 2000r/min，7min离心 上清液 沉淀物 酶复合物 酶复合物沉淀 加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心 加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液 4200r/min,5min离心 加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心 冻存备用 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白 （0.1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 待测酶蛋白 (ml) 0 0 0 0 0 0 0 1.0 磷酸缓冲液 (ml) 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 考马斯亮蓝 (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 吸光度A 0 0.115 0.148 0.245 0.395 0.525 0.582 0.140 （稀释5倍） 根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量 试管号 1 2 3 4 5 ? ? ? ? ? 1%酪蛋白