肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌细胞中表达的初步研究.docVIP

肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌细胞中表达的初步研究 　　【摘 要】目的：研究肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌中的表达，探讨XAF1在肺腺癌耐药发生、发展中的作用，为基因治疗耐药肺腺癌提供理论依据。方法：本研究培养人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP和其亲本株A549，通过MTT法测定A549/DDP对顺铂的耐药指数；采用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测两种细胞及凋亡细胞（顺铂作用48h后的A549细胞）中XAF1、XIAP mRNA的表达水平变化。结果：A549和A549/DDP细胞对顺铂的IC50分别为5.52±0.12?mol/L、34.96±0.74?mol/L，因此，A549/DDP对顺铂的耐药指数为34.96/5.52=6.33，确定为耐顺铂的非小细胞肺癌细胞；RT-PCR结果显示A549/DDP细胞较正常A549细胞XAF1 mRNA表达水平下调（P0.05），正常A549细胞组较凋亡细胞XAF1 mRNA表达水平下调（P0.05）；XIAP mRNA的表达A549/DDP细胞组明显高于凋亡细胞（P0.01），且A549/DDP细胞组XIAP mRNA的表达高于正常A549细胞组（P0.05），正常A549细胞组XIAP mRNA的表达高于凋亡细胞（P0.05）。 结论：顺铂耐药肺腺癌细胞株中肿瘤抑制基因XAF1表达降低或缺如，XIAP基因表达明显增强，XAF1、XIAP作为凋亡相关基因现已被肯定，XAF1在肺腺癌顺铂耐药过程的发生、发展中可能起一定作用。 　　【关键词】人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP；XIAP相关因子1；细胞凋亡 　　【中图分类号】R655 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0038-02 　　材料与方法 　　一、材料 　　人非小细胞肺癌A549细胞株属我院实验室保存，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所；人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心（北京大学肿瘤临床学院建系，其亲本细胞A549来源于ATCC）；DDP购自山东齐鲁制药有限公司（10mg/支，批号；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；Trizol试剂（Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）；特异性引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。 　　二、方法 　　1 细胞培养 人非小细胞肺癌A549细胞培养在DMEM（含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）培养液中，人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞培养在含有2mg/L DDP的DMEM培养基中，置37℃、饱和湿度、含5%C02和95%空气的恒温培养箱中培养，隔2-3天换液一次，定期传代，进行试验前1周更换为不含DDP的DMEM培养基以减少DDP对实验的干扰，全部实验均采用指数生长期的A549细胞和A549/DDP细胞。 　　2 MTT法测定A549/DDP细胞的耐药指数 取对数生长期的A549和A549/DDP细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度接种于无菌96孔板中，每孔200ul（细胞数约为5×103）。每组设6个复孔。根据预实验结果，A549细胞分别加入DDP终浓度为0?mol/L、1.25?mol/L、2.5?mol/L、5?mol/L、7.5?mol/L、10?mol/L的DMEM培养基，A549/DDP细胞分别加入DDP终浓度为0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、30?mol/L、40?mol/L、50?mol/L的DMEM培养基，继续培养，每24h换液一次，浓度同前，培养至44小时时取出96孔板，根据试剂盒说明书行MTT检测，并计算不同浓度的DDP对A549细胞和A549/DDP细胞的生长抑制率。然后根据SPSS17.0软件得出A549细胞和A549/DDP细胞对DDP的IC50值。耐药指数又称耐药倍数，指耐药细胞对某种药物的半数抑制浓度（IC50）除以敏感细胞的半数抑制浓度，本研究中即耐药细胞A549/DDP对DDP的IC50/敏感细胞A549对DDP的IC50。 　　3 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测A549和A549/DDP细胞中XAF1、XIAP基因的表达 　　参照Trizol试剂盒说明书提取两种细胞的总RNA，取终浓度为2.5?mol/L的DDP作用48h之后的A549细胞作为对照组，按RT-PCR试剂盒说明书操作。XAF1引物序列：正义5’-GAGGAGATAAAGCAGCCTATGAC-3’反义5’-CTCTTGCCTGATTGCTGTGG-3’XIAP引物序列：正义5’-TACAGGCATGCTCCACGGTG-3