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第三章 免疫学检测技术 韶关学院生科院 易道生 内容 掌握抗原抗体反应的原理与特点，了解抗原抗体结合力和比例。 掌握免疫组化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的选择与使用。 掌握酶联免疫检测（ELISA）反应的原理方法。 掌握免疫印痕（Western blot）的技术原理与方法。 了界放射免疫检测技术（RIA）的原理与方法。 目标： 掌握ELISA、IHC、 Western blot的操作方法 免疫学检测技术就是利用抗原和抗体高度特异性结合的原理和方法，检测分析各样品中的目标物质，以监控物品质量、检测机体免疫机能和诊断某些疾病的体外检测方法。 免疫检测是微量检测方法，灵敏、特异。随着方法和技术的改进，免疫检测方法已渗入工、农、食品、医药等各个领域。 从20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。 本章主要学习血清学检测方法——抗原抗体检测方法。 第一节 免疫学检测的基本原理 抗原抗体反应指抗原与相应抗体间的特异性结合反应。曾叫血清学反应。 一、抗原抗体的特异性结合 抗原抗体的结合反应，在体内可介导溶细胞效应、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套机体体液免疫功能。 体外反应有凝集作用、沉淀作用、调节作用、中和作用等。 1、抗原抗体的互补性和亲和性 抗原抗体的结合是基于抗原决定簇（表位）与抗体超变区分子间的互补性和亲和性。 互补性指抗原表位的空间结构与抗体分子超变区内的抗原结合位点间的空间结构互补嵌合。 亲和性指抗体分子上的抗原结合位点与相应抗原表位间互相适应产生的吸引力。 互补性是Ag和Ab结合的基础，亲和性是Ag和Ab 间固有的作用力。 2、抗原抗体结合力 抗原和抗体分子的结合可以是游离形式的，也可以结合在细胞表面。这种结合也是非共价键结合。 抗原与抗体相互结合只局限于分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。 抗原抗体间的作用力有： 抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以下几种： 1、盐键（离子键） 2、范德华力 3、疏水作用 4、氢键 3、亲水胶转化为疏水胶 抗体和大部分抗原在溶液中是亲水胶，不会聚沉。一旦破坏电荷和水化层，如Ag + Ab，减少电荷，由亲水胶转化为疏水胶，形成可见的Ag –Ab复合物沉淀。 利用此沉淀反应可检测相应的抗原或抗体。 二、抗原抗体反应的特点 1、特异性 抗原与抗体相互结合必须有空间构型的互补性，因此，有很强的特异性。 但，如果两种抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗体间构型有部分或全部相同，就可能出现交叉结合——凝集或沉淀。 既可能干扰实验，也可以用于扩大应用范围。 2、比例性 抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与反应物的量（浓度）有关。 比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应物浓度的关系。 只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生成可见的复合物。 在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和抗体。 滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物产生明显可见的反应所需的最小量。 抗原抗体反应的等价带（zone of equivalence）：曲线的高峰部分，抗原抗体分子比例合适的范围。在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。 最适比（optimal ratio）：其中有一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适。 带现象（zone phenomenon）：等价带前后分别为抗体或抗原过剩则无沉淀物形成。 前带（prezone）：抗体过量 后带（postzone）：抗原过剩。 3、可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应。 Ag + Ab Ag-Ab 高亲和力抗原表位和抗体超变区的构型非常适合，结合牢固，不易解离。解离取决于： 抗体对相应抗原的亲和力 环境因素对复合物的影响 当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。 4、阶段性 抗原抗体反应被人为分为2阶段。 结合阶段： 当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段。 反应阶段：在一级阶段之后，继