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细胞凋亡多事件发生 早期：AnnexinV（PS外翻） 早中期：JC-1( 线粒体膜电位) 中晚期：caspase-3、8、9（western） 晚期： TUNEL （ DNA 片段） 不同时期凋亡检测指标 早期凋亡特征： 磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此 PI染色为阴性 DNA没有发生断裂 AnnexinV（磷脂结合蛋白） 对照设置： 空白对照：不加AnnexinV/PI,用以调节电压，阴阳性细胞界限 单阳对照：诱导凋亡，AnnexinV/ PI单染，用来补偿 双染阴性对照：未诱导的 AnnexinV+PI双染。用它确定两荧光通道电压，排除非特异性结合 注意： 细胞制备或存储时细胞膜损伤，造成假阳性 贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子 当样本表达GFP时，禁用AnnexinV-FITC 推荐使用AnnexinV-APC/7-AAD染色 JC-1(BIC2)检测线粒体膜电位变化 原理：JC-1有单体跟多聚体两种形式。浓度高时，JC-1呈多聚体，可以产生红色荧光；在浓度较低时，JC-1为单体，可以产生绿色荧光。 正常细胞：膜电位正常， JC-1随线粒体膜极性进入线粒体，随浓度升高而成多聚体，发红色荧光。 凋亡细胞：线粒体膜去极化， JC-1从线粒体释放，浓度降低，转为单体，发绿色荧光。通过检测红绿两种荧光区分。 Caspase-3检测 -细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶)。 –Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即 Caspase 3激活=细胞凋亡 TUNEL检测 凋亡晚期特征 —DNA内切酶活性激活升高，双链DNA切断形成~185bp的有序片段。 —Tunel流式法:基因组DNA断裂时，暴露的3‘-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素?(FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，通过流式细胞仪进行检测。 一步法 FITC-dUTP染色凋亡细胞 流式细胞仪488nm激发，PI发出623nm荧光，FITC发出520nm 荧光 两步法 PI染总DNA(周期) FITC-dUTP染色凋亡细胞（如不需要周期信息，可不做PI染色） TUNEL检测 TUNEL检测 小结：细胞凋亡---流式分析 活细胞 细胞凋亡流式分析 固定细胞 膜不对称性改变AnnexinV 线粒体膜电位变化 Mitoscreen(JC-1) TUNEL/DNA片段化 流式的其他应用 黏附因子 表面受体 细胞因子 分泌到胞外的细胞因子 胞内抗原 核酸含量 核内抗原 流式细胞仪预约使用规范 CytoFlex预约使用规范 每周一、三、五（10:00-16:30）为流式预约使用时间段 需要使用流式的同学请至少提前一天预约 预约成功后，必须准时上机检测 临时有事不能进行实验的同学，请至少于检测前一小时告知 实验结束后，及时带走检测完的样本，并登记检测时间 数据拷取必须使用实验室配备专门U盘。 谢谢！！ * * 光信号是比较微弱的，我们需要对光信号做等比例放大，信号的放大可以使用线性或对数两种方式 * 流式细胞术从字面意思上很好理解 就是对流动中的细胞进行分析的技术，我们这里指的细胞是指流动中的单个细胞。对细胞进行分析是指对细胞理化性质进行分析。究竟是如何实现对单个细胞理化性质分析呢？。 * * * 荧光越强说明细胞表面抗原表达量越多 * 当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠. * * * * 细胞皱缩 胞浆致密 染色质边集 核碎裂 凋亡小体形成 * * * * 流式细胞术---理论及应用 主要内容 流式细胞术简介 流式细胞术应用 细胞周期检测 细胞凋亡检测 流式细胞仪预约使用规范 附二院分析型流式细胞仪 BD Canto II 二激光六色(自动上样，同时容纳40个样本) 488nm 蓝激光 633nm 红激光 Beckmen Cytoflex 双激光六色（单上样管，半自动上样） 488nm 蓝激光 635nm 红激光 流式细胞仪基本构造 液流系统 流动室 液流驱动系统 光学系统 激发光源 光束收集系统 电子系统 光电转换器 数据处理系统 荧光信号 电信号 数字信号 流式细胞术:用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光