止消通脉宁干预转化生长因子―β1诱导人肾小管上皮细胞表型转化的研究.docVIP

止消通脉宁干预转化生长因子―β1诱导人肾小管上皮细胞表型转化的研究 　　摘要：目的 观察止消通脉宁药物血清对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）表型转化的影响，并探讨其机制。方法 将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养基培养并分为空白对照组、TGF-β1诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）、空白血清对照组（TGF-β1 10 ng/mL+10%空白血清）、干预1组（TGF-β1 10 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁药物血清）、干预2组（TGF-β1 10 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁药物血清）、干预3组（TGF-β1 10 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁药物血清）。药物干预24 h后，免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。在24、48、72 h应用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的含量。结果 正常HK-2细胞表达E-cadherin，不表达α-SMA，经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变，E-cadherin的表达明显减弱，α-SMA表达明显增强，且ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌明显增加，与空白对照组比较差异有统计学意义（P0.05）。止消通脉宁药物血清干预后α-SMA表达明显减弱，E-cadherin表达明显增强；同时抑制了ColⅠ、Col Ⅲ和FN的分泌，与TGF-β1诱导组比较差异有统计学意义（P0.05）。结论 止消通脉宁在一定程度上能够抑制人肾小管上皮细胞表型转化，减少细胞外基质成分的分泌，具有防治肾间质纤维化的作用。 　　关键词：止消通脉宁；转化生长因子-β1；人肾小管上皮细胞；表型转化；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；纤连蛋白 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0037-03 　　糖尿病肾病（DN）是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一，严重影响糖尿病患者的生活质量和生命健康。DN的发病机制尚未明确。既往认为DN的早期病变部位在肾小球，近年来研究发现肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性更为密切，故肾间质纤维化的机制在DN的发展中越来越受到人们的重视[1]。本课题所选止消通脉宁是北京中医药大学东直门医院著名老中医吕仁和教授治疗DN的临床经验方，已在临床作为院内制剂应用多年，在治疗DN方面具有一定的临床疗效[2-4]。本实验通过观察止消通脉宁干预转化生长因子-β1 （TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞表型转化及对细胞外基质成分的影响，进一步探讨其对肾间质纤维化的作用，为其防治DN肾间质纤维化提供依据。 　　1 实验材料 　　1.1 细胞株 　　人肾小管上皮细胞（HK-2），购自兰州大学实验中心。 　　1.2 动物 　　Wistar大鼠48只，雄性，体质量（200±20）g，SPF级，甘肃中医学院动物中心提供，许可证号：SCXK（甘）2004-0006。 　　1.3 药物与试剂 　　DMEM/F12（1∶1）细胞培养基，Gibco公司生产；胎牛血清，Hyclon公司生产；EDTA、胰蛋白酶，Amresco公司生产；人Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的ELISA试剂盒，RB公司生产；鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体，Abcam公司生产；兔抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体，Cell Signaling（CST）公司生产；免疫组化试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。人重组TGF-β1，购自RD System公司，根据说明书，用含1 mg/mL牛血清白蛋白的无菌弱盐酸（4 mmol/L）配制为1 ?g/mL的储存液，无菌EP管-70 ℃储存，用时配成10 ng/mL浓度[5]。止消通脉宁颗粒（主要由黄芪、生地黄、鬼箭羽、夏枯草、莪术、大黄、三七等药物组成），北京市金药源药物研究院提供，批6 g/袋，成人临床用量1袋/次，3次/d。 　　1.4 仪器 　　二氧化碳培养箱，HEAL CELL HL90，LIKANG；超净生物安全柜，ESCD CLASSⅡBSC，Airstream；倒置显微镜，Olympus X-71， Olympus，JAPAN；酶标仪，CliniBio 128L-400。 　　2 实验方法 　　2.1 止消通脉宁药物血清制备 　　Wistar大鼠饲养于中国人民解放军兰州军区总医院屏障级动物实验室[许可证号：SYXK-（军）2007-022]，普通饲料喂养。随机分为空白组及止消通脉宁低、中、高剂量组，每组12只。适应性喂养1周后，中药组分别按成人临床