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S M A R T 技术 背景介绍 真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3‘末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。 但是由于cDNA的5端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。 技术历程 常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3‘末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。 但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。 SMART(Switching Mechanism At 5‘ end of the RNA Transcript(SMART)技术的出现是一个新的里程碑。 原理：在合成cDNA的反应中事先加入的3末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。 这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。 几个采用SMART技术的产品（Clontech） SMART PCR cDNA Synthesis Kit SMART cDNA Library Construction Kit SMART RACE cDNA Amplification Kit Creator SMART cDNA Library Construction Kit Altas SMART Probe Amplification Kit Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit SMART PCR cDNA Synthesis Kit 功能： 由ng级的RNA的到高质量的cDNA文库 选择性得到新的带5’端的全长cDNA 用LD连接介导的PCR产生全长cDNA 可与CreatorTM 表达系统配套使用 这个试剂盒是采用SMART技术将少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA制备成可大量扩增的cDNA。 试剂盒提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一链Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和纯化cDNA用的纯化柱和对照RNA在内的试剂。 首先利用专利的SMARTTM寡聚核苷酸合成第一链，再利用LD PCR技术生产高质量的全长cDNA双链。比较传统的GublerHoffman cDNA合成法，SMART技术能得到更高比例的全长克隆，得到完整的mRNA 5’端非编码区。 SMART PCR cDNA Synthesis Kit SMART PCR cDNA Synthesis Kit 在SMART技术中，第一链合成一个经修饰oligo(dT)引物-----CDS II primer(Sfi IB),而SMART II 寡核苷酸(Sfi IA)作为mRNA 5’端延伸出去的模版。当反转录到达mRNA 5’端时，反转录酶跳移并继续反转录至SMART II寡核苷酸的末端，这种跳移常常发生在真核生物mRNA的帽子结构-------m7G。这样反转录出的cDNA包含mRNA完整的5’端以及SMART III寡核苷酸互