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L/O/G/O Novoprotein 专业实践报告 报告人： 学 号： 2014.1.18 熟悉、了解、掌握质粒EGFP和LGALS1分别作为模板，设计引物扩增EGFP基因和LGALS1基因，通过Novorec的方法将两个片段同时重组到pET21a载体上的相关理论知识。 绿色荧光蛋白-人LGALS1融合蛋白大肠杆菌的表达载体的构建及纯化 理论学习 抽提质粒作为模板，扩增EGFP基因和LGALS1基因，重组到pET21a载体上，表达筛选，蛋白检测，蛋白纯化。 实验操作 A 接菌抽提、PCR反应、电泳检测 B C 重组、转化 、阳性鉴定 D 酶切过夜、电泳检测、产物回收 质粒抽提、电泳检测 SDS电泳检测 E Western Blot 免疫印迹 F G 带His标签的人重组蛋白的纯化 一、 接菌抽提、PCR反应、电泳检测 Kit抽提 ↓ PCR反应 ↓ 电泳上样检测 质粒抽提检测 PCR反应检测 二、 酶切过夜、电泳检测、产物回收 PCR反应产物酶切 ↓ 37℃恒温水浴锅过夜 ↓ 配胶 ↓ 电泳检测 ↓ 割胶回收 酶切产物电泳检测 三、 重组、转化 、阳性鉴定 目的基因、载体重组 ↓ 转化 ↓ 挑菌、37℃培养 ↓ PCR阳性鉴定 ↓ 电泳检测 四、 质粒抽提、电泳检测 碱法抽提质粒→电泳检测 五、 SDS电泳检测 Lane A:诱前 Lane B :G-2-1 Lane C:G-2-2 Lane D:Marker Lane E: G-2-3 Lane F:G-2-4 Lane G:G-4-1 Lane H: G-4-2 Lane I : G-4-3 Lane J:G-4-4 A B C D E F G H I J 结论：通过做western blot进一步确定是否为目的条带。 六、Western Blot 免疫印迹 标签 C-His 抗体 C-His 抗体-HRP Lane A:Prestained Molecular weight marker Lane B:I-1-1 Lane C:I-1-2 Lane D:I-1-3 Lane E:诱前 Lane F:阳 Lane G:81 Lane H:82 Lane I :83 A B C D E F G H I 结论：综合SDS,此株菌均有表达。 七、RFP Purification batchProtein expression(2014-01-12) A B MK Medium:XY1,4L, OD600: 2.0,add 0.1mM IPTG,incubate at 16℃ over night. End OD600: 7.1 Cell weight:48.4g Batch:RFP-4L菌种编号：RFP-1 Target protein was expresses obviously Lane A:non-induced crude Lane B:induced crude MK:Molecular weight marker 60KD 120KD 20KD 90KD 40KD 30KD 14KD Lysis by ultrasonication(2014-01-17) Lysis buffer: 20mMTris, 250mMNaCl ， 10mM imidazole pH8.0 (40ml) Cell:2g(:RFP-4L A B C MK
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