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KLK14在宫颈癌组织中的表达及其意义 　　【摘要】 目的 探讨KLK14蛋白宫颈癌中的表达及与临床病理关系。方法 应用免疫组织化学法SP检测10例正常宫颈14例慢性宫颈炎48宫颈癌组织中KLK14蛋白的表达。应用半定量逆转录聚合酶链反应法RTPCR检测25例宫颈鳞癌及10例正常宫颈组织中KLK14 mRNA的表达。结果 KLK14蛋白在48例宫颈癌中阳性率729%，正常宫颈20%，慢性宫颈炎143%，三者相比差异有统计学意义，KLK14蛋白阳性率与肿瘤临床分期，病理学相关（P005）。KLK14 mRNA在宫颈癌相对表达量高于正常宫颈组织。结论 KLK14表达参与宫颈癌的发生发展。 　　【关键词】 宫颈鳞癌；人激肽释放酶14；逆转录聚合酶链反应 　　基金项目：河南省卫生厅课题项目（项目编号：2008046） 　　作者单位：450052 郑州大学第五附属医院 宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，疗效总体生存率不高，经常地进行评估是必须的，激肽释放酶（kallikrein，KLK）家族是目前被研究与恶性肿瘤表达相关的基因家族， 参与体内多种生理病理过程。KLK14是KLK家族中一员，拟采用SP及RTPCR研究宫颈癌细胞内KLK14蛋白及mRNA的表达，探讨其在宫颈癌中发生发展意义及与临床病理的关系。 　　1 资料与方法 　　11 一般资料 48例宫颈癌取自2007年1月至2010年1月我院手术切除标本，正常宫颈10例，慢性宫颈炎14例来源于同期子宫切除术标本，所有标本部分存于80℃冰箱中用RNA提取，另一部分用福尔马林固定石蜡包埋进行SP检测。患者年龄29～71岁，中位年龄435岁。宫颈癌病理：鳞状细胞癌43例，腺癌5例，分期：I 期21例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，IV期5例。分级：G1 12例，G220例，G3 16例。淋巴转移者17例，无淋巴转移者31例。所有患者均为初发者，术前均未接受过放化疗治疗。同期取正常宫颈组织10例和25例宫颈鳞癌行RTPCR实验。 　　12 主要试剂山羊抗人KLK14多克隆抗体（Santn Cruz公司）和SP9003三步法试剂盒（兔抗羊，北京中杉公司）Trizol试剂购自invitrogen公司，AMV逆转录试剂盒（AMV3500）购自promega公司。ExTaq酶试剂盒购自大连宝生物公司。KLK14及βactin引物由上海生工生物有限公司合成。RTPCR仪器为biorid公司产品。 　　13 方法 　　131 SP法 所有组织标本固定石蜡包埋，4 μm厚连续切片，每批染色均设阴性和阳性对照。阴性对照采用磷酸盐缓冲液（PBS） 代替一抗，阳性对照取已知KLK蛋白表达阳性的乳腺癌组织的石蜡切片。 　　132 RTPCR法 采用Trizol一步法提取组织总RNA，取1 μg总RNA，用AMV逆转录试剂盒进行反转录获得cDNA（逆转录反应参照试剂盒说明进行），取2 μg cDNA为模板进行PCR反应，KLK14上游引物序列为5CCGCAGACTTCACCACTCG TAT3，下游引物序列为5AGGTGTGAGGCAGGCGIAAF3，用βactin作为内参照，上游引物为5TGGCAGGACTTCA GA3，下游引物5AGTGGCTAGAAGTTCACC3，[1]。PCR反应条件为：95℃预变性4 min， 95℃变性30 sec，56℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，35个循环后最后72℃延伸5 min，所有的反应体系均做2管，作为平行对照。在实验过程中，每次结束均将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物长度。紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度。 　　14 阳性结果判定标准免疫组织化学 参照文献[2]制订。KLK14蛋白定位细胞浆，显示胞浆为淡黄色或棕黄色者为阳性细胞，凡显色强度与背景无明显差异者为阴性，而显色强度高于背景为阳性表达，将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级，表达阳性细胞数小于10%，染色强度为弱阳性或仅个别细胞呈中至强阳性染色，即为表达弱阳性（+）；阳性细胞为60%以上，多数细胞呈黄色或棕黄色染色，即表达强阳性+++；表达的阳性细胞数及强度介于上述二者之间为阳性（++）。 　　15 统计学方法 采用SPSS 110统计软件。各计量资料比较应用t检验（经正态性检验和方差齐性检验），KLK14表达与临床参数关系采用χ2检验，P005表示差异具有统计学意义。 　　2 结果 　　21 sP染色显示KLK14蛋白定位于宫颈上皮细胞浆，阳性表达率简表1，三者相比差异有统计学意义 　　22 KLK14蛋白表达与宫颈癌病理的关系（见表2）KLK14蛋白的表达与临床分期、病理学有关，与年龄、组织学分级和淋巴结转移无。 　　23 KLK14 mRNA在不