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ClC—3荧光真核表达载体的构建及表达 　　[摘要] 目的 构建表达ClC-3的荧光真核表达载体，为研究其在肿瘤细胞中的作用提供分子工具。 方法 将ClC-3的编码序列亚克隆到pEGFP-N1质粒，构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，利用脂质体介导将ClC-3基因导入人乳腺癌细胞MCF-7内，通过绿色荧光观察检测基因的表达。 结果 成功构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，该载体转染MCF-7细胞后，可观察到绿色荧光。 结论 表达ClC-3的荧光真核表达载体构建成功，并在乳腺癌细胞中得到正确表达，为进一步研究ClC-3在乳腺癌中的作用奠定了基础。 　　[关键词] ClC-3；MCF-7细胞；荧光真核表达载体；转染 　　[中图分类号] R737.9，R453 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）10（b）-0004-03 　　ClC-3是ClC氯离子通道家族成员之一，对维持细胞容积平衡、调节细胞电活动等多种生理功能发挥重要作用，是正常细胞生长和增殖必不可少的元件。近年有文献报道，在宫颈癌、乳腺癌和恶性胶质瘤中ClC-3的表达都远高于正常组织[1]，ClC-3可以通过参与细胞体积减小即凋亡性容积减小（apoptotic volume decrease，AVD）的过程来参与肿瘤细胞的凋亡调控[2]，而且还可能参与了肿瘤细胞周期依赖性的细胞迁移过程[3]。因此，ClC-3可能是与肿瘤的发生发展、转移和凋亡过程密切相关的关键分子之一。本研究采用基因重组技术构建ClC-3与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的融合蛋白ClC-3-EGFP，并检测其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达，为进一步探讨ClC-3在乳腺癌中的作用提供分子工具。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂 　　携带ClC-3全长cDNA的质粒pcDNA3.1/ClC-3由芝加哥大学Deborah J.Nelson教授惠赠；真核表达质粒pEGFP-N1、大肠埃希菌DH5α、乳腺癌细胞株MCF-7为本实验室保存；内切酶BamHⅠ、SacⅠ，T4 DNA连接酶均购自NEB公司；LA Taq酶购自大连宝生物公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。 　　1.2 PCR扩增ClC-3的编码序列 　　以质粒pcDNA3.1/ClC-3为模板，用PCR扩增出ClC-3的编码序列，上游引物序列为5′-CTTAGAGCTCATGGAG-TCTGAGCAGCTGTT-3′，引入了Sac Ⅰ位点；下游引物序列为5′-CAGTGGATCCATGTTGAACATTATTGAAGCGG-3′，引入了BamH Ⅰ位点。PCR反应体系：50 μl体系中模板DNA 0.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μl，LA Taq（5 U/μl）0.5 μl，2×GC Buffer Ⅰ 25 μl，dNTP Mix 8 μl，ddH2O 12 μl。反应参数：94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，30个循环，最后72℃延伸10 min，产物2476 bp。反应结束后0.8%琼脂糖凝胶电泳观察结果及切胶回收目的DNA片段。 　　1.3 ClC-3荧光真核表达载体的构建和鉴定 　　PCR产物和质粒pEGFP-N1分别用Sac Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，回收ClC-3和pEGFP-N1线性化载体片段，然后T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，挑取阳性克隆，扩增培养细菌后提取质粒，Sac Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切处理进行鉴定，酶切鉴定正确的克隆送华大基因进行测序鉴定，获得pEGFP-N1/ClC-3真核表达质粒。 　　1.4 细胞培养 　　将乳腺癌细胞MCF-7放在含10%胎牛血清和0.01 mg/ml牛胰岛素的DMEM完全培养基中培养，置于37℃、含体积分数5%CO2饱和湿度培养箱。细胞每隔2 d传代一次，取对数生长期细胞进行培养。 　　1.5 脂质体法转染乳腺癌细胞和绿色荧光观察 　　收集细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，按1 ml/孔接种于24孔细胞培养板，待细胞达到70%～80%汇合度时，按说明书操作，用Lipofectamine 2000转染pEGFP-N1/ClC-3质粒。同时，以转染pEGFP-N1质粒作为空载体组，只加脂质体作为空白对照组。转染48 h后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，并拍照。 　　2 结果 　　2.1 PCR结果 　　以pcD