健脾养血祛风法对小鼠皮肤屏障功能影响的实验研究.docVIP

健脾养血祛风法对小鼠皮肤屏障功能影响的实验研究 　　摘要：目的：观察健脾养血祛风法对皮肤机械屏障功能障碍小鼠动物模型的影响。方法：1.小鼠表皮神经酰胺含量的测定；2.小鼠皮肤屏障功能障碍瘙痒模型的研究；3.健脾养血祛风法对大黄致小鼠脾虚皮肤屏障功能障碍的影响。结果：大黄模型组小鼠皮肤屏障功能障碍时表皮神经酰胺含量降低，瘙痒次数增加，表皮厚度明显增厚。结论：健脾养血祛风法可以减轻大黄法所致脾虚血燥小鼠瘙痒程度，提高神经酰胺含量健脾养血祛风法能改善大黄法所致小鼠脾虚血燥证的皮肤机械屏障功能障碍 　　关键词：脾虚血燥；皮肤机械屏障功能障碍；神经酰胺；健脾养血祛风法 　　中图分类号：R285.5文献标识码：A 　　文章编号：1007-2349（2012）12-0058-03 　　角质层是皮肤表皮的最外层，能直接体现出皮肤的外观和健康状况，并在保障皮肤正常的屏障功能上起重要作用。神经酰胺（ceramide）是一种类磷脂，它占角质层脂质中40%～50%比重，是角质层的主要成分，它在保持角质层水分平衡，维护皮肤屏障功能起到极其重要的作用，相当于角质细胞砖之间泥浆的主要成分，表皮层除去神经酰胺就能使皮肤屏障功能几近丧失。 　　特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）患者不仅病变部位皮肤神经酰胺的含量明显减少，并且正常皮肤处神经酰胺的含量也较正常人低，经表皮丧失水分也叫正常人多，常伴有皮肤干燥症[1～2]。皮肤神经酰胺含量的减少是特应性皮炎患者皮肤屏障功能低下的指标。瘙痒是特应性皮炎的一个重要特征[3]。 　　本实验通过复制大黄所致脾虚动物模型并进一步复制瘙痒（血燥）模型，通过程度其表皮神经酰胺含量这一皮肤屏障功能的重要指标，瘙痒行为及表皮厚度，探讨健脾养血祛风法对皮肤机械屏障功能的影响，探索特应性皮炎中医治疗规律及机制。 　　1实验基础条件测定、仪器及材料 　　1.1小鼠表皮脂质的抽提及表皮中神经酰胺含量测定 　　1.1.1取材选用ICR小鼠，将小鼠处死，剪毛，取下剪毛后的皮肤，用直径为8 mm的打耳器经剪下的皮肤打成0.5 cm2 大小的皮肤圆片，每只鼠打6个圆片作为一份皮肤样品，总面积为3 cm2 　　1.1.2实验仪器BIO-RAD GelDoc凝胶成像系统，匀浆机 FLUKO F6/10，高速离心机 北京京立离心机有限公司LG10-2.4A，低温冰箱 日本产SANYO MDF-U33，电子天平上海普利塞斯有限公司 XS125A。 　　1.1.3药品与试剂神经酰胺标准品和朊酶：美国西格玛公司，氮气（昆明氧气厂），磷酸盐缓冲液（PBS 液），正乙烷，乙酸乙酯，氯仿，甲醇氨水，硫酸铜，磷酸，醋酸 产自国药集团化学试剂有限公司（均为分析纯）；其他材料：定量毛细管，薄层色谱硅胶板，定量滤纸，薄层色铺展开缸，耳肿打耳器，移液器。 　　1.1.4表皮中神经酰胺含量测定将所取皮肤浸泡于朊酶液中，放置过夜，分离表皮，按BlightDyer法[4]抽提表皮脂质，-40℃保存。 　　1.1.4.1对照品溶液的制备精密称取神经酰胺对照品0.0052 g，置5 mL容量瓶中，加氯仿适量，振摇使溶解，加氯仿稀释至刻度，摇匀。从中精密吸取1 mL溶液，置5 mL容量瓶中加氯仿适量，振摇使溶解，加氯仿稀释至刻度，摇匀。即得0.208 mg/mL对照品溶液。用0.10 mL氯仿溶解所抽提出的脂质，即得供试品溶液。 　　1.1.4.2供试品溶液的制备用0.10 mL氯仿溶解所抽提的脂质，即得供试品溶液。 　　1.1.4.3薄层色谱条件薄层板：北京颇赛科技公司Silca gel 60，点样：点样基线距底边1 cm，将样品点于基线上。展开：薄层板于氯仿：甲醇：水（80∶20∶1）中上行展开，取出晾干。显色：硫酸铜磷酸溶液显色，与140℃下烘至显色。 　　1.1.4.4含量测定方法显色后的薄层板用BIO-RAD GelDoc 凝胶成像系统采集图像，Quantity One 软件分析，进行含量测定。 　　1.1.4.5方法学考察工作曲线的绘制：精密吸取对照品溶液2、4、6、8、101分别点于统一薄层板上，按上述薄层色谱条件展开、显色、采集图像、分析定量。经神经酰胺线性关系考察后，利用回归方程计算相关系数，表明神经酰胺在0.416～2.08 μg范围内，含量与密度积分值线性关系良好。 　　1.2瘙痒测定方法[5] 　　1.2.1造模方法于造模前1 d，剪掉颈背部毛，用4 cm2脱脂棉蘸取丙酮、乙醚混合液（1：1）覆盖于剪毛处15 s，而后取另一4 cm2脱脂棉蘸取蒸馏水覆盖于剪毛处30 s，2次/d，2次时间间隔至少为6 h。 　　1.2.2瘙痒行为[5]于第14 d观察各组动物瘙痒行为，在BI-2000医学图像分析