原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF表达分析.docVIP

原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF表达分析 　　【摘 要】本文目的在于对原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190和LIF表达进行分析，以了解其对妊娠建立的可能影响。本文成功地建立了血sgp190双抗体夹心ELISA测定法。原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF浓度表达异常，sgp190可能对人体整个循环中LIF表达具有负调节作用，从而影响胚泡着床而造成不孕。 　　【关键词】白血病抑制因子；可溶性gp190；酶联免疫吸附实验；胚泡着床 　　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　1.1.1 实验材料 　　LIF ELISA检测试剂盒（RD Systems）、抗gp190胞外区抗体由晶美公司提供。抗sgp190多克隆抗体、sgp190亲和纯化品由本研究室制备[ 1]。 　　1.1.2研究对象 　　实验组：17例不明原因原发不孕症患者来源于重庆医科大学附属第一医院，平均年龄28.6士3.7年，不孕年限3～10年，平均3.56士0.89年。 　　纳入标准：年龄≦35岁，不孕年限3年，月经周期28～30天，基础体温双相，高温相≥12天，分泌中期血孕酮≥32nmol/L，血PRL正常， 基础内分泌正常，夫妇双方染色体核型正常，抗精子抗体阴性，宫腔镜检查子宫正常，腹腔镜检查为正常盆腔，子宫、输卵管外观正常，6个月内未用过激素类药物，男方精液检查正常。 　　对照组：19例，平均年龄27.7士4.8年，纳入标准：除继往有正常生育史外，其它同实验组。 　　试验得到受试者知情同意。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 双抗体夹心sgp190 ELISA检测的建立及方法学鉴定 　　1.2.1.1 HRP标记抗体的制备：见文献常规方法，用改良碘酸钠法标记亲和层析纯化抗sgp190多克隆抗体。 　　1.2.1.2双抗体夹心ELISA法的建立与双抗体工作浓度的确定（采用方阵滴定法） 　　以包被缓冲液稀释抗gp190胞外区部分McAb 至浓度为1、2、4、6μg/ ml，分别在酶标板上进行包被过夜。洗涤3次。在各孔中加入封闭液，37 ℃保温2 h ，洗涤3 次。在各孔中分别加入gp190 抗原液5μg/ ml，37 ℃保温2 h，洗涤3 次。加入系列稀释的酶标抗体兔抗人sgp190（稀释度为1：500-1：3000）100?l，37℃下孵育l h，洗涤5 次。在各孔中加入HRP-羊抗兔IgG抗体，1/ 10000 稀释，100μl/ 孔，37 ℃保温1 h，洗涤6 次。加底物显色。加2mol/ L H2SO4 终止反应后，读取OD450 nm 值。以OD450 nm 值为1 左右的条件作最佳条件，以此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。 　　1.2.1.3建立标准曲线 　　以确定浓度的抗人sgp190 McAb包被酶标板，加稀释的标准抗原0.5- 100ng/ml （10 ?g / ml的标准抗原4?l，加396 ?l稀释液成100 ng/ml，然后倍比稀释成0.5- 50ng/ml）。不同浓度的标准品都设四个平行测定孔，37 ℃1 h，洗3 次；加入稀释的兔抗人sgp190抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加入确定稀释度的HRP-羊抗兔IgG抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加底物溶液100μl / 孔。37 ℃避光反应10～15 min，2 mol / L H2SO4 终止反应，酶标仪450 nm处读取OD 值。以标准抗原（ ng / ml） 为横坐标，相应OD值为纵坐标绘制标准曲线。 　　1.2.1.4 检测方法准确性分析（回收实验，Recovery assay） 　　在已知sgp190 浓度的血浆中加入不同浓度的sgp190标准液，用已建立的ELISA方法测回收率。 　　1.2.1.5检测方法精确度分析 　　取3 份血浆标本，做批内和批间测定，计算CV，分析制备sgp190 ELISA检测方法的精确度。 　　1.2.1.6健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期（月经周期第19～21d）血浆sgp190浓度测定 　　按上述标准曲线，利用建立的ELISA法测定健康女性与不孕患者植入窗口期血浆中sgp190浓度，每个样本作2个复孔。 　　1.2.2 健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期（月经周期的第19～21天）血浆LIF浓度测定 　　LIF ELISA检测试剂盒灵敏度8 pg /ml ，批内CV 2.5 % 批间CV 7.1 % ，回收率102%，具体操作步骤按说明书进行。 　　1.2.3 统计学处理 　　实验结果用mean±SD表示，用 SPSS 10.0软件进行统计学分析，P0.05 视为差异具统计学显著性意义。 　　2