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重组艾塞那RP―HPLC法肽图分析 　　[摘要]目的建立并验证胰蛋白酶裂解-反向高效液相色谱法进行重组艾塞那肽肽图分析研究。方法将重组艾塞那肽样品用胰蛋白酶水解，酶解所得的肽段通过反相高效液相色谱法进行分析，采用cs色谱柱，以0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液为流动相A，以0.1%TFA的乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱70min，得到重组艾塞那肽肽图，以此进行方法的专属性、重现性、定量限、批间同一性研究。结果本实验室制备的重组艾塞那肽可以通过胰蛋白酶裂解RP―HPLC法进行肽图分析，专属性、重现性均满足要求，定量限为0.125mg/mL，三个批次间的肽图谱也完全一致。结论表明此方法简便可靠、准确度高、重复性好，验证研究可行，可用于重组艾塞那肽的质量控制。 　　[关键词]重组艾塞那肽；肽图；胰蛋白酶裂解；高效液相色谱；方法研究；质量控制 　　艾塞那肽（Exendin-4）是毒蜥唾液腺中分泌的一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物，为含有39个氨基酸的多肽。该产品首次由美国Amylin制药公司开发合成，目前国内市场由瑞典阿斯利康公司进口销售，在临床中已大量应用，降低餐后血糖效果好见效快，主要用于控制血糖，减轻体重，改善胰岛素抵抗。目前该药品无其他公司生产，且无药典收藏质量标准。本实验室通过前期的研发，自主构建载体，利用基因工程技术在大肠杆菌体内重组表达艾塞那肽，经过纯化、浓缩、冻干等工艺，得到重组艾塞那肽。 　　目前，控制基因工程药物一致性的一个重要手段就是肽图分析（peptide mapping analysis），肽图分析技术灵敏高效的特点使其成为对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行验证的首选方法。该技术不但可以比较重组与天然蛋白质结构之间的差别，还可帮助判别样品在生产过程中是否发生了变化，以验证生产工艺和样品的稳定性，所以肽图分析也是考察供试品与对照品之间以及不同批次产品之间同一性的重要手段。本研究采用胰蛋白酶对重组艾塞那肽进行酶解，以RP-HPLC法对酶解的肽段进行分析，与合成艾塞那肽进行一致性比对，并对3批重组艾塞那肽进行了肽图分析，建立重组艾塞那肽的质量控制方法以及验证研究，得到较好的结果。 　　1仪器与试剂 　　1.1仪器 　　高效液相色谱仪（Agilent 1260）；电子天平（Sartorius BSA224S-CW）；超纯水仪（MilliporeMilli-Q）；超声仪（舒美KQ-300VDV）；真空泵（天津GM-0.50）；水浴锅（Fisher215）。 　　1.2试剂材料 　　乙腈（色谱醇，Fisher公司，LOTl36911）；三氟乙酸（分析纯，sigma，BCBJ6836V）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢铵、醋酸等（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；胰蛋白酶（Sigma，LOT#SLBFl700V）；艾塞那肽合成品（上海吉尔生化有限公司，批号P140218）；重组艾塞那肽（自制，批号Exl50108、Exl50322、Exl50603）；其他试剂均为分析纯。 　　2方法与结果 　　2.1色谱条件 　　经反复实验后，确定重组艾塞那肽纯度测定的实验色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse C。（4.6x250mm，粒径5μm）；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液，梯度洗脱70min（A液从100%～30%，B液从0～70%）；流速110mL/min；柱温30℃；检测波长为214nm；进样量100μL；系统适用性要求满足。 　　2.2样品处理 　　取样品使用磷酸盐缓冲液进行溶解，使浓度约为1mg/mL，使用1%碳酸氢铵溶液进行透析，取2mL透析液，加入400μL经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的胰蛋白酶溶液（0.1 mg/mL，溶剂为1%碳酸氢铵溶液），37℃水浴保温20h后，加入240μL50%醋酸溶液，混匀后用0.45μm滤膜滤过，取滤过液进样。 　　2.3专属性研究 　　取重组艾塞那肽、合成艾塞那肽以及空白溶液按照上法同步操作，液相色谱仪上样，记录色谱图，结果见图1，空白溶液中（A）只有溶剂峰，重组艾塞那肽（C）与合成艾塞那肽（B）酶解后的肽段峰一致。结果表明使用HPLC法对艾塞那肽进行肽图分析的专属性研究满足要求，使用基因工程技术表达出的重组样品具有与合成样品一致的一级结构。 　　2.4重现性研究 　　员工A取重组艾塞那肽按照上法操作，液相色谱仪上样，重复实验3次（每样进2针）；员工B于另一天同法操作，重复实验3次（每样进2针）。记录色谱图，选取色谱图中5个主峰，计算峰面积及相对保留时间进行比对，结果见表1。从表中数据可知，各峰面积及相对保留时间CV值均≤2.0%，表明本实验室样品重组