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壁虎提取物诱导HepG2肝癌细胞凋亡的研究 　　摘要：目的：探讨壁虎提取物（GEE）对体外培育人肝癌HepG2肝癌细胞凋亡的影响。 　　方法：采用MTT法考查GEE对HepG2增殖的抑制作用，普通光镜观察、荧光染色法观察细胞形态的改变及细胞凋亡，流式细胞仪（FMC）观察细胞周期变化和凋亡峰的出现。 　　结果：0.4～1.6mg/ml壁虎提取物对HepG2增殖产生抑制作用，且呈明显的时-效、量-效关系（P0.05）。光镜观察可见贴壁细胞数量明显减少，细胞碎片和悬浮细胞数目明显增加，荧光染色显示细胞核显著收缩，呈致密浓染。FCM结果表明1.6mg/ml壁虎提取物处理细胞24h后使HepG2出现明显的凋亡峰，并将细胞周期阻滞于S期和G2/M期。 　　结论：壁虎提取物能诱导HepG2细胞凋亡。 　　关键词：壁虎细胞凋亡HepG2 　　【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1008-1879（2012）11-0009-02 　　壁虎又称守宫、天龙、蝎虎等，古代“五毒”之一，具有补肺肾、易精血、通络起废、镇痉祛风等功效。壁虎在临床广泛地用于治疗多种疑难杂症，对多种恶性肿瘤，尤其是肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌等常见多发恶性肿瘤有独特的疗效。近年来对该药的研究有不少进展，但目前对壁虎抗肿瘤机制不明了。壁虎作为中药还未载入国家药典，还未得到应有重视，国内外同仁对其有效成分、作用机制研究不多。因此研究壁虎对体外肿瘤细胞增殖的抑制作用有可能发现壁虎的抗癌机制。本文拟对壁虎提取物为研究对象，研究其体外作用人肝癌HepG2细胞后的增殖抑制情况，能否诱导凋亡及相关分子机制，为壁虎的药用开发提供科学理论和临床应用依据。 　　1实验材料 　　1.1细胞株。人肝癌细胞株HepG2（ATCC，美国）。 　　1.2药物。壁虎或为壁虎科动物无蹼壁虎或其他几种壁虎的全体。处理方法：高速组织捣碎机使细胞裂解，离心，抽提，旋转蒸发冷冻干燥，浓缩成干粉。 　　1.3主要试剂及试剂盒。MTT（Genview），细胞凋亡-Hoechest染色试剂盒（南京凯基生物发展有限公司），RPIM1640（GIBCO），胎牛血清（杭州四季青），碘化丙啶（Sigma），青霉素/链霉素（HyClone公司），其余药品均为国产分析纯。 　　1.4主要仪器。荧光倒置显微镜（OLYMPUS公司），倒置显微镜XSZ-D2型（重庆光学仪器厂），冷冻干燥仪（MARTIN CHRIST公司），酶标仪（中科院生物物理所），BI-2000生物医学图像分析系统（成都泰盟公司），流式细胞仪（Beckman公司）。 　　2实验方法 　　2.1HepG2细胞的培养和处理。HepG2进入对数生长期时可进行以下操作。 　　2.2细胞毒性试验。采用MTT法：实验设调零组（空白组）、阴性对照组、药物处理组。药物处理组设定7个不同浓度（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml），计算增殖抑制率。 　　2.3普通光镜细胞形态观察。细胞接种方法同细胞增殖抑制实验，经一定量梯度浓度的药液处理48h后，和阳性对照组（阿霉素处理）、阴性对照组的HepG2细胞置于倒置光学显微镜下观察细胞形态。 　　2.4荧光染色观察细胞凋亡。将无菌盖玻片置于六孔板内，于盖玻片上种入细胞培养过夜，待盖玻片上细胞汇合度约为50%-80%时加入一定量的药液，继续培养24h。设对照组。后按照细胞凋亡-Hoechest染色试剂盒的说明操作，用荧光倒置显微镜（激发波长340nm，吸收波长450nm）观察拍照。 　　2.5FCM检测。收集经一定浓度药物作用24h后1×107个细胞，冷PBS（PH7.2，0.1M）清洗2遍，70%的冷乙醇于4℃固定后送检，每个样品测试约1.2×104个细胞。 　　3实验结果 　　3.1壁虎对HepG2增殖的抑制作用。壁虎提取物各剂量组均有一定程度的抑制HepG2细胞增殖，并且随着剂量和时间推移，抑制率增强，具有明显时间依赖性和剂量依赖性。 　　3.2普通光镜观察结果。阴性对照组HepG2细胞生长密集，细胞呈梭形或多角形，细胞彼此之间紧密接触。壁虎提取物处理后的贴壁细胞面积变小出现圆形或椭圆，间有细胞碎片，细胞数量明显减少，同时细胞形态发生变化，细胞从多边形变成圆形，呈凋亡细胞改变，胞浆出现空泡，体积缩小，细胞间隙增大，随时间推移，细胞数目进一步减少，见较多的凋亡和坏死细胞；阳性对照细胞小而圆，细胞数量剧减，呈凋亡细胞改变，可见凋亡和坏死并存现象。 　　3.3荧光染色结果。正常HepG2细胞核较大，呈弥散均匀蓝色荧光，但蓝色荧光较浅；实验组的细胞形态不规则，细胞核或细胞质内可见致密浓染的荧光颗粒，新月样荧光，蓝色荧光的强度较大。坏死对照组也可见颗粒状荧光，