早期糖尿病大鼠视网膜中TSP—1和VEGF的动态变化及意义.docVIP

早期糖尿病大鼠视网膜中TSP—1和VEGF的动态变化及意义 　　【摘要】 目的 检测血小板反应蛋白-1（TSP-1）和血管内皮生长因子（VEGF）在糖尿病大鼠视网膜中的表达情况。方法 采用链脲佐菌素（STZ）诱导10只大鼠糖尿病模型， 另取10只正常大鼠作为正常对照组， 免疫组织化学方法检测TSP-1和VEGF蛋白质在大鼠视网膜的表达情况。结果 糖尿病组大鼠视网膜TSP-1阳性表达较正常对照组降低（P0.01）。糖尿病3个月时， VEGF在视网膜的阳性表达高于正常对照组（P0.05）。结论 TSP-1低表达和VEGF过表达之间的不平衡可能在早期糖尿病视网膜病变过程中起到调控作用。 　　【关键词】 糖尿病视网膜病变；免疫组织化学；血小板反应蛋白-1；血管内皮生长因子 　　糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病严重的微血管并发症之一， 是导致双眼不可逆性盲的重要原因， 其发病机制比较复杂， 受多种血管刺激因子和抑制因子调控。其中血小板反应蛋白-1 （thrombospondin-l ， TSP-1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）是目前发现的作用较强的眼部新生血管抑制因子和促进因子。作者用免疫组织化学方法检测TSP-1 和VEGF蛋白质在大鼠模型中的表达及变化， 以希望对早期DR的发病机制有进一步的了解。 　　1 材料与方法 　　1. 1 实验动物分组及模型建立 实验用封闭群雄性Wistar大鼠40只， 体质量200～260 g， 将链脲佐菌素（streptozotocin， STZ；Sigma公司）按60mg·kg-1腹腔内注射， 注射后48 h检测尿糖和血糖。血糖浓度达16.65 mmol·L-1， 尿糖达+++以上为模型建立成功。成模后每月检测一次鼠尾血糖。实验组10只，另取正常对照组10只。正常组大鼠腹腔注射0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液。 　　1. 2 眼球标本的取材和制片 各组大鼠3个月时以10%水合氯醛腹腔麻醉。麻醉成功后灌注多聚甲醛约300 ml。摘除眼球， 浸泡固定24 h。常规浸蜡， 包埋， 备用。将制好的眼球标本切片， 用于免疫组织化学染色。 　　1. 3 各组大鼠视网膜TSP-1和VEGF表达的检测 采用免疫组织化学SP-9002法， 小鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体购自美国NeoMarkers公司， VEGF单克隆抗体、SP-9002免疫组织化学试剂盒及显色试剂盒购于中山生物工程有限公司。操作步骤为：切片脱蜡至水；体积分数3﹪H2O2 滴加切片上， 室温孵育15 min；微波修复抗原15 min， 滴加正常山羊血清封闭非特异性抗原15 min；滴加TSP-1一抗（稀释度为1：100）或VEGF一抗（稀释度为1：300）， 4℃过夜；生物素化二抗工作液15 min；辣根酶标记链霉素卵白素工作液15 min， DAB显色， 复染， 脱水， 透明， 封固镜检。阴性对照实验以磷酸缓冲液代替一抗。 　　1. 4 统计学方法 采用Image-Pro Plus 图像分析系统测定视网膜TSP-1和VEGF的积分光密度，数据以x-±s表示， 采用SPSS13.0统计学软件进行t检验， 以P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2. 1 各组TSP-1免疫组织化学染色结果 光镜观察正常组中TSP-1蛋白质的阳性反应表达分布于视网膜的内界膜、内丛状层、内核层、外丛状层， 呈深棕黄色；糖尿病大鼠视网膜TSP-1蛋白质的阳性表达较正常组显著降低， 尤其在内丛状层、外丛状层呈极微弱的阳性表达见表1。 　　2. 2 各组VEGF免疫组织化学染色结果 光镜观察 正常组大鼠VEGF阳性反应在视网膜分布于内核层及节细胞层， 胞浆呈棕黄色， 胞核未显色。糖尿病组大鼠视网膜中VEGF蛋白质的阳性表达分布于内核层及节细胞层， 表达增强， 胞浆呈深棕黄色， 内核层阳性反应细胞增多， 见表1。 　　3 讨论 　　糖尿病视网膜病变（DR）是常见致盲性疾病， 基本病理过程表现为微循环障碍， 主要病理改变为视网膜血管渗透性增加， 从而促进视网膜缺血缺氧及新生血管形成， 最终导致视功能损害[1]。近年来的研究表明， 其中血小板反应蛋白-1 （TSP-1）和血管内皮生长因子（VEGF）是重要的眼部新生血管抑制因子和促进因子， 它们在眼底新生血管生成过程中起着重要作用[2]。TSP-1是可由多种细胞分泌的抗新生血管因子， 是一种重要的多肽类内源性血管新生抑制物[3]。TSP-l还可与细胞表面受体、蛋白酶、及细胞外基质发生作用， 可刺激细胞增生， 并参与胚胎发育、组织分化、细胞迁移、血管生成、炎症以及凝血与纤溶等病