②皮质醇的测定.pptVIP

实验十五 血清睾酮与皮质醇（T/C）测定及应用 1 实验目的 ⑴通过实验使学生掌握人体激素血皮质醇和睾酮测定方法及意义，为体育教学和运动训练提供指导。 ⑵进一步巩固离心机、可调微量移液器、振荡器等仪器的基本操作。 2 实验器材与试剂 2 实验器材与试剂 ⑴仪器：芬兰产1470γ计数器、恒温水浴箱等。 ⑵试剂 ①血睾酮的测定：使用包被-抗体-计数放射免疫试剂盒，其中包括总睾酮抗体包被试管、125I标记溶液、睾酮溶液和睾酮标准品。 ②皮质醇的测定：使用包被-抗体-计数放射免疫试剂盒，其中包括总皮质醇抗体包被试管、125I标记皮质醇溶液和皮质醇溶液和皮质醇标准品。 ③材料：人体静脉血等 3 实验原理⑴血睾酮的测定原理 ⑴血睾酮的测定原理 放射免疫分析中应用放射性同位素标记物进行检测。 其分析的基础是标记抗原（*Ag）和被测抗原即非标记抗原（Ag）限量的特异性抗体（Ab）的竞争性抑制反应，是结合分析中的一类方法。则于标记原和非标记抗原的免疫活性完全相同，因此与特异性抗体具有相同的亲和能力。 通常以下列方式表示：在标记抗原和特异性抗体量恒定时，由于标记原抗体复合物的形成受非标记抗原（待测浓度的物质）的含量限制，所以当样品中非标记抗原含量高时，非标记抗原对特异性抗体的竞争能力强，非标志抗原抗体复合物的形成量就多，实验结果所计量到的标记性抗原抗体复合物放射活性就低；相反，样品中非标记抗原含量低时，非标记抗原对特异性抗体的竞争能力弱，非标记抗体复合物形成就少，实验结果所计量到的标记性抗原抗体复合物放射活性就高。其之间形成一定的逆相关函数关系。 ⑵血清皮质醇的测定原理 ⑵血清皮质醇的测定原理： 放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）测定血清皮质醇浓度的实验方法，测试原理同血清睾酮的测定。 4 实验方法与步骤 4 实验方法与步骤㈠ 血睾酮的测定 ㈠ 血睾酮的测定 ① 将包被试管、125 I睾酮标记液用标准品处于室温状态，并充分混合标准品，碘标记液（轻轻翻转）。 ② 分取标准液A、B、C、D、E、F各50ul于包被试管中，做双管标准曲线以保证测试数据的准确。 ③ 取样品血清50ul，直接滴入包被试管底部。 ④ 将1.0ml125I睾酮碘标记加入每个已加入了标准品或测试样品的试管中。在振荡器上振混匀1min。 ⑤ 将加入1251标记的试管置于37℃水浴箱中，温育3h。 ⑥ 将温育后的溶液全部倒出，在吸水纸上击试管，将管内溶液尽力甩出。 ⑦ 按标准管、样品管的顺序依次将试管放入测试架，在γ计数器上进行计数测定。 ㈡ 皮质醇的测定 ㈡ 皮质醇的测定 ①将包被试管、125I皮质醇碘标记液及标准品于室温状态下，并充分混合标准品、碘标记液（轻轻翻转）。 ②分取标准液A、B、C、D、E、F各25μl于包被试管中，做单管标准曲线。 ③取样品血清25μl，直接滴试管底部。 ④将1.0 ml 125I皮质醇碘标记液加入了标准品或样品的试管中，在振荡器上振荡混合1 min。 ⑤将加好碘标记液的试管置于37℃水育箱中，温育45min。 ⑥将温育后的溶液全部倒出，在吸水纸上叩击试管，将溶液尽力甩干。 ⑦ 按标准管-样品管的顺序依次将试管放入测试架，在γ计数器进行测定。 ⑴血睾酮的测定 ①采集1ml全血，避免溶血，静置析出或离心后得到澄清的血清，血清量不少于100μl。 ②向包被试管中加入样品时，吸头不要触及管底部的药膜。 ③温育时可用小盖子或塑料薄膜纸盖住试管，以防止蒸气形成的水滴掉入试管中。 ⑵血清皮质醇的测定 ①血样收服最好为晨静脉血，离心后应达到血清澄清进行测定。 ②向包被试管中加入样品时，吸头不要触及管底部的药膜。 ③温育时可用小盖子或塑料薄膜纸盖住试管，以防止蒸气形成的水滴掉入试管中 5 注意事项 5 注意事项