gbt××××—××××1gbt××××—××××前言本标准是首次制定。本.docVIP

前 言 本标准是首次制定。 本标准附录A为资料性附录。 本标准由中国有色金属工业协会提出。 本标准由全国有色金属标准化技术委员会归口。 本标准由中南大学资源加工与生物工程学院负责起草。 本标准主要起草人：邱冠周 刘学端 柳建设 刘新星 申丽 王军 本标准由全国有色金属标准化技术委员会负责解释。 嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其活性的基因芯片检测方法 范围 本标准规定了利用基因芯片技术检测嗜酸氧化亚铁硫杆菌(以下简称A.f菌)及其活性的术语、定义、符号、省略语、主要技术指标和待测样品的要求、样品图谱的制作及分析方法。 本标准适用于利用基因芯片技术来高效快速的筛选A.f菌，确定待测样品中A.f菌株的氧化活性及其浸矿性能。 方法原理 A. f 菌的浸矿性能与其对亚铁和硫的氧化能力及其环境适应性相关，而这些特征都是受基因控制的。利用获得的纯A.f 标准菌ATCC 23270 及其全部3217个基因序列信息构建高通量的基因芯片技术，通过不同活性类型（高氧化活性菌和低氧化活性）A.f 菌与基因芯片的杂交，找到高氧化活性菌的特征基因及其与浸矿作用密切相关的功能基因的表达情况，根据待测样品特征基因的有无和比例以及功能基因的表达水平评定A.f 菌的浸矿性能。 试剂和材料 本试验所用水为高纯水（电导率大于18MΩ）。 试剂 十二烷基磺酸钠（SDS，分子式：CH3(CH2)10CH2SONa） 硫酸亚铁（FeSO4） 苯酚（C6H5OH） 氯仿（CHCl3） 异丙醇（(CH3)2CHOH） 乙醇（C2H5OH） 乙酸钠（CH3COONa） 异丙基乙醇 甲酰胺（C3H7NO） 二甲基亚砜（(CH3)2SO） 蓝色荧光标记cy5（C37H37N2O8S2K） 红色荧光标记cy3（C31H42N2O8S2K） 溶液 9K培养基(pH2.0～pH2.5) 成份：(NH4)2SO4 3g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·H2O 0.5g,Ca(NO3)2 0.01g，浓度为5mol/L的H2SO4 1.0mL，FeSO4·7H2O 44.3g,蒸馏水 1000 mL。 Rnase Mini Kit试剂盒 成份：无Rnase水，缓冲液RLT、RDD、RPE，漂洗液RW1，贮存液Dnase I。 DNA荧光标记试剂盒 DNA荧光标记试剂盒包括以下试剂： 3.2.3.1 DNA荧光标记混合液1（每管35μL）：随机引物缓冲液 20μL，DNA xμL（总量500ng），dH2O (15-x) μL； 3.2.3.2 DNA荧光标记混合液2（每管15μL）：dNTP（5mmol/L dA/G/CTP、2.5mmol/L dTTP） 1μL，klenow 2μL，Cy3/Cy5 dUTP 0.5μL，dH2O 11.5μL； 3.2.3.3 Tris-HCl：浓度0.1mol/L。 RNA荧光标记试剂盒 3.2.4.1 RNA荧光标记混合液1：加入RNA10μg，随机引物缓冲液10μg，内参10-3w/w~10-6w/w； 3.2.4.2 RNA荧光标记混合液2：加入5倍缓冲液6μL，0.1mol/L DTT 3μL，dNTP(10mmol/L dA/G/CTP、0.5mmol/L dTTP)0.5μL，RNA酶抑制剂1μL，1mmol/L cy3/cy5 dUTP 1μl； 3.2.4.3 Tris-HCl：浓度0.1mol/L。 杂交溶液 3.2.5.1 杂交混合液1：甲酰胺15μL，纯水5.6μL； 3.2.5.2 杂交混合液2：鱼精DNA2.4μL，5% SDS2μL，20倍SSC 5.04μL（每管溶液总体积为30μL）； 材料 用作对照的菌株为模式A.f菌ATCC 23270，由美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，简称ATCC）保存并提供。 仪器、设备 PCR 仪 分光光度计：能测量DNA和RNA浓度和纯度 基因芯片点样仪：通量50张玻片以上， 步进精度1um～2.5um（X 、Y 和轴Z 轴），点的平均大小为75um -300um，点样密度：10000点/标准玻片。 基因芯片扫描仪：最大扫描区域22×71.5mm，两组激光器(绿色和红色荧光, 适用Cy3/ Cy5 标记)，最大分辨率为5um, 在分辨率范围内5um -100um可自由选择，检测灵敏度0.05分子/平方微米以下，变异系数均小于5%。 样品制作 取样要求 采样地点 从典型的酸性矿坑水、积液池或浸矿堆采样，确保样品具有代表性。 采样温度 要求气温在15℃以上。 采样方法 在每一样地采用5点取样法采样，并将所采样品混合后用于富集培养。 样品的富集培养及其要求 采用9K培养基(pH2.0～pH2.5)以FeSO