实验三.ppt-杭州师范大学生命与环境科学学院.ppt

实验三 荧光显微镜结构与使用方法 杭州师范大学 刘姬艳 实验目的与教学要求 掌握荧光显微镜的成像基本原理及其使用 荧光显微镜 Fluorescence microscope 荧光素的特性 荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态 转变为高能状态，再回到低能状态时释 放出的光，是非温度辐射光——冷光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 荧光(fluorescence) 荧光的性质： - 荧光波长＞激发波长（损失热能） - 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、 荧光效率 荧光显微镜的种类： 透射式 落射式 透射式 汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜 落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 荧光显微镜 落射荧光显微镜光路图 透射荧光显微镜光路图 荧光显微镜 特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 荧光光源 一般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。 荧光显微镜 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。 使用方法: 1.打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到 最亮点。 2.落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求 的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3.放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意： 末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的 损伤； 4.高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟 后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 荧光显微镜 1.对细胞结构或组分的定性、定位、半定量研究 2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物 应用: 荧光显微镜 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） Figure Fluorescent probes. Dividing cells seen with a fluorescence microscope after staining with specific fluorescent dyes. Here DNAs are stained green, and microtubule proteins are stained red with a fluorescent antibody 荧光显微镜 DNA: green Microtubule: red Figure Multiple-fluorescent-probe microscopy. In this composite micrograph of a cell in mitosis, three different fluorescent probes have been used to stain three different cellular components. The spindle microtubules are revealed with a green fluorescent antibody, centromeres with a red fluorescent antibody and the DNA of the condensed chromosomes with the blue fluorescent dye DAPI. 荧光显微镜 Microtubules: green Centromeres: redDNA: blue 试剂与器材 洋葱、1‰ 丫啶橙、滤纸、吸管、 载玻片、荧光显微镜 实验内容和实验步骤 取洋葱→撕取一小片内表皮→1‰丫啶橙染色5min →水洗→室温干燥（或用滤纸擦干） →荧光显微镜观察 吖啶橙是最经典的荧光染料，它可对细胞中DNA和RNA同时染色而显示不同颜色荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。 吖啶橙荧光染色的原理 原理：吖啶橙（acridine orange, AO）是一种荧光染料，其激发峰为492nm（蓝光），荧光发射峰为530nm (DNA)及640nm(RNA)，在蓝光（492nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和 胞质RNA发桔红色荧光(＞580nm)。 图pEGFP-IFI16转染Hep-2细胞 图 pEGFP-C1转染Hep-2细胞 ◆荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。 ◆使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发 光源，保护眼睛。