DBI讲座--qPCR--细节决定成败教案.pptVIP

我们为中国的客户带来更好的.......... FREE!!! 我们的生产地——路德维希港（德国） 使用DBI Bioscience的qPCR(SYBR GREEN)最近发表的文章（影响因子20.22分） VEGFR-3 in MacrophagesRestrains TLR4-NF-κB Signalingand Protects against Endotoxin Shock 举例说明： 误差分析及操作规范 如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。 1. 模板浓度越低，染料法的误差越大 误差分析及操作规范 2. 某一孔荧光信号特别强 原因：① 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多； ② 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同； ③ 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染； 3.样品浓度跨度过大 样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线， 误差分析及操作规范 4. 部分样本扩增效率过低 原因：① 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；② 反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效； 误差分析及操作规范 5. 阴性对照或空白对照翘尾 原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染； 误差分析及操作规范 6. 直线型扩增曲线 原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物； 误差分析及操作规范 7.山坡形曲线 原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。 误差分析及操作规范 8.扩增曲线断裂 原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致， 因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据 误差分析及操作规范 9.基线下滑 原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致； 误差分析及操作规范 荧光定量PCR定量原理 为什么终点定量不准确呢？ 荧光定量PCR定量原理 尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cycle threshold）与模板起始浓度有密切联系。 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Cycle（循环数） Rn（荧光强度） Ct value 荧光定量PCR原理－－Ct值 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值 荧光定量PCR原理－－荧光阈值 定量PCR的数学原理 定量PCR的数学原理 定量PCR的数学原理 定量PCR的数学原理 线性关系、扩增效率确认 检测灵敏度确认 No Template Control(NTC)确认 PCR扩增效率（E）:0.9-1.1 35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增 35 Cycles内无引物二聚体产生 相关系数（r2）：大于0.98 荧光定量PCR反应性的确认 内容概要 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法 非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe 常用荧光标记方法 SYBR Green I染料法——原理 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。 SYBR Green I 热 变 性 引物退火 延伸反应 SYBR Green I染料法——作用机理 问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生， 也将 同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。 SYBR Green I染料法——问题点与关键点 关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！ 将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱 对数图谱 SYBR Green I染料法——融解曲线 融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 SYBR Green I染料法——融解曲线 对DNA模板没有