表阿霉素免疫纳米微粒靶向抗肝癌作用的研究.docVIP

表阿霉素免疫纳米微粒靶向抗肝癌作用的研究 　　[摘要] 目的 制备表阿霉素（E-ADM）免疫纳米微粒（NPs），观察其对荷人肝癌裸鼠模型的靶向治疗效应。 方法 利用聚电解质复合法合成载表阿霉素纳米微粒（E-ADM-NPs），化学交联法合成载表阿霉素的抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）单克隆抗体纳米微粒（E-ADM-Ab-NPs），观察E-ADM-Ab-NPs在荷人肝癌裸鼠模型体内的分布特点，观察药物的靶向抗肿瘤效应及其毒副作用。 结果 E-ADM-Ab-NPs保留了抗VEGFR2单克隆抗体的活性；E-ADM-Ab-NPs组肿瘤组织中的E-ADM浓度为（31.85±4.78） mg/kg，显著高于E-ADM-NPs组（P 0.05）；而E-ADM原药组的血白细胞计数较空白对照组下降42.68%，血清谷丙转氨酶水平则升高88.06%（P 0.05）。 结论 E-ADM-Ab-NPs具有免疫活性，其在动物模型体内呈导向性分布，可提高E-ADM的疗效并有效降低E-ADM的毒副作用，是一种安全的新型药物纳米靶向制剂。 　　[关键词] 表阿霉素；聚电解质复合法；载药纳米微粒；肝癌；血管内皮生长因子；靶向给药 　　[中图分类号] R735.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0021-03 　　目前原发性肝癌的治疗是以手术为主的综合治疗，但总的手术切除率仅有20%～30%，且术后2年复发率高达50%[1]，因此化疗依然是肝癌治疗重要的辅助手段。为提高传统化疗药物的疗效并减少其毒副作用，靶向给药日益成为治疗肝癌的有效方法，而单克隆抗体和载药纳米微粒则是当前研究的热点[2-4]。笔者在前期研究中选择生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料海藻酸钠和阳离子瓜尔胶，利用聚电解质复合法制成具有良好缓释性能的载表阿霉素纳米微粒（E-ADM-NPs）[5]。本研究将进一步探讨E-ADM-NPs与抗VEGFR2单克隆抗体的交联，并观察交联物（E-ADM-Ab-NPs）对荷人肝癌裸鼠模型的抗肿瘤作用，以期用于原发性肝癌的靶向治疗。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂与动物 　　海藻酸钠（温州东升试剂厂）；阳离子瓜尔胶（美国Economy公司）；盐酸表阿霉素（法玛西亚有限公司）；抗VEGFR2单克隆抗体（美国Biodesign公司）；碳化二亚胺（EDC）（美国Pierce公司）；人肝癌Bel 7402细胞株（由中科院上海细胞生物研究所提供）；三级BALB/c裸鼠（由中山大学医学动物实验中心提供）。 　　1.2 E-ADM-Ab-NPs的制备及抗体活性的检测 　　依据文献方法[5]，利用聚电解质复合法制备E-ADM-NPs和未载药NPs。称取10 mg E-ADM-NPs和2 mg抗VEGFR2单抗溶于pH值7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，缓慢加入5 mg EDC，4℃条件下搅拌2 h而后静置过夜。将所得溶液离心后用蒸馏水洗涤3遍，冷冻干燥即可制得E-ADM-Ab-NPs。依法制备未载药Ab-NPs，参考文献[6]利用酶联免疫测定法（ELISA）对E-ADM-Ab-NPs和未载药Ab-NPs中抗VEGFR2单抗的活性进行检测。 　　1.3 荷人肝癌裸鼠模型的建立 　　取对数生长期的人肝癌Bel 7402细胞，用含15%小牛血清的PRMI 1640培养液按1×107/mL的浓度配成细胞悬液供皮下接种。取一定数量4～6周龄的三级BALB/c裸鼠，分别于右侧肩胛部皮下种植0.1 mL细胞悬液，饲养2周后选择生长良好、皮下肿瘤直径0.5～0.7 cm的裸鼠用于肿瘤治疗试验，饲养6周后选择生长良好、皮下肿瘤直径约1.0～1.2 cm的裸鼠用于药物的组织分布试验。 　　1.4 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的分布 　　取体重为（20±2）g/只的荷人肝癌裸鼠12只（雌雄各半），随机分为E-ADM-Ab-NPs组和E-ADM-NPs组，两组按含E-ADM 5 mg/kg的剂量分别经尾静脉注射E-ADM-Ab-NPs及E-ADM-NPs。每只裸鼠给药后1 h经眼静脉窦取血1.0 mL作样品，然后断颈处死裸鼠，手术分别取出肿瘤、心脏、肝脏、肾脏等组织作样品。利用高效液相色谱法（HPLC）检测荷人肝癌裸鼠组织和血液中E-ADM的浓度。 　　1.5 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的抑瘤试验 　　取体重为（18±2）g/只的荷人肝癌裸鼠48只（雌雄各半），随机分为8组，每组6只。A组：E-ADM-Ab-NPs组；B组：E-ADM-NPs组；C组：Ab-NPs组；D组：E-ADM原药加抗VEGFR2单抗组；E组：E-ADM原药组；F组：抗VEGFR2单抗组；G组：未载药NPs组