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虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测研究 　　[摘要] 目的 分析虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测效果，建立一种用于虫草属的DNA分子指纹高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测方法。 方法 分别对虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶终浓度、胶电泳步骤、胶固定方案、胶染色方法、胶显色步骤进行分析，确定利于虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶DNA多态性展现的方案。 结果 确定虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测方案，分别为聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%、银染染色液为0.3%的AgNO3、胶显色步骤中显影液为强碱NaOH和0.5%的甲醛溶液，且NaOH的浓度为2%。 结论 本研究所建立的银染检测及显带体系适用于虫草属基因组聚丙烯酰胺凝胶电泳研究。 　　[关键词] 虫草属；聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染技术 　　[中图分类号] R503 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0022-03 　　虫草属Cordyceps（Fr.）Link是一大类昆虫病原真菌，其特定的菌感染特定的昆虫后才成为具有重要的药用价值的冬虫夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]，该属伪品种类繁多，品质高低各异[1]。虫草属的种质资源丰富，属间物种的形态极其相似，但仅有蝙蝠蛾科虫草为《中国药典》2010年版规定的冬虫夏草。现代药理药效学研究显示，蝙蝠蛾科虫草对吞噬肿瘤细胞的能力是硒的4倍，所含的虫草素能明显增强红细胞黏附肿瘤细胞的能力，抑制肿瘤生长和转移，明显提升白细胞和血小板的数量，可辅助治疗鼻咽癌、肺癌、白血病、脑癌等恶性肿瘤；减轻组织水肿，可多用于脑水肿的辅助治疗，防治急性肾功能衰竭等疾病，预防和控制慢性支气管炎、肺源性心脏病，迅速改善放、化疗后的呕吐恶心、头发脱落、失眠等症状。另外，蝙蝠蛾科虫草所含的特有成分虫草多糖为免疫调节剂，临床治疗及保健用途广泛。在美国，因其对于恶性肿瘤预防控制的特殊贡献，已将其列为抗肿瘤新药，目前已进入临床三期的研究[2-3]。 　　因受自然条件的限制，天然蝙蝠蛾科虫草资源日益紧缺，价格昂贵，一些不法分子利用劣质或亚香棒虫草代替蝙蝠蛾科虫草，其治疗效果受到伪品及劣质品严重影响，甚至对人体产生毒副作用，鉴别和评价同属不同科的虫草显得尤为重要[4]。目前，其检测方法多为生药学鉴定，薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等主要化学方法鉴定，分子水平鉴定也开始进行[5-8]。 　　药用真菌虫草属的DNA指纹图谱检测方法中所采用的放射显带方法和荧光显带方法具有一定的局限性，放射显带方法对环境和实验人员均有高污染的风险，而荧光显带方法所需要的仪器昂贵，难以普及。另外，低污染而应用普遍的传统聚丙烯凝胶电泳银染显带方法操作时间长、步骤多，采用试剂繁多，易造成显带背景颜色浓、分辨率低、条带模糊的情况，导致显带结果不准确。本文分别对虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶终浓度、胶电泳步骤、胶固定方案、胶染色方法、胶显色步骤进行分析，确定利于虫草属分子聚丙烯酰胺凝胶DNA多态性展现的方案，现报道如下： 　　1 材料与仪器 　　1.1 材料 　　虫草属Cordyceps（Fr.）Link样品由海军医学研究所汪家春副研究员鉴定。丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED购自Takara生物公司；尿素（Urea）购自Sigma公司；硝酸银、剥离硅烷、亲和硅烷购自北京鼎国生物工程公司；引物、接头由上海生物工程技术服务有限公司完成；其余试剂均为国产分析纯。 　　1.2 仪器 　　DYCZ-20A型电泳槽、DYY-12型电泳仪电源（北京六一仪器厂），P270型摇床（中国科学院武汉科学仪器厂），PCR仪（德国Biometra公司），DK-S12型电热恒温水浴锅（上海华连医疗器械有限公司），高速离心机（德国Eppendorf公司），PL3002型电子天平（METTLER TOLEDO公司）。 　　2 方法 　　2.1 配制缓冲液及常用试剂 　　2.1.1 TE缓冲液的配制 用pH 8.0为10 mmol/L Tris-HCl及1 mmol/L EDTA配制，配制溶液高压灭菌后室温保存。 　　2.1.2 5×TBE 缓冲液的配制 在800 mL双蒸水中加入Tris、硼酸和pH为8.0的EDTA，定容至1 L后室温保存。 　　2.1.3 1 mmol/L Tris-HCl的配制 在双蒸水中加入Tris-HCl，双蒸水取800 mL，用浓HCL的剂量调节pH值，定容至1 L后室温保存。 　　2.1.4 5 mol/L EDTA的配制 称取186.1 g乙二胺四乙酸二钠盐·2H2O溶于800 mL双蒸水，用NaOH的剂量调节pH值，调至pH 8.0，定容至1L后室温保存。 　　2.1.5