PCR技术原理与应用.doc

PCR技术原理 一、实验目的：1、理解PCR的技术原理；2、了解PCR的应用领域 二、实验原理： 1 概念 ?PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）是模拟体内DNA复制过程，对特定DNA序列进行大量扩增的一种技术。?PCR反应是以4种dNTP为底物，引物引导，DNA聚合酶催化作用下，在单链DNA模板3’末端开始进行互补链的延伸，多次反复的扩增使特定DNA序列以指数增加。 2、PCR反应体系 参与PCR反应的物质主要为包括：引物、酶、dNTP、Buffer、模板和Mg2+。 ?2.1 引物 引物是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应. 引物设计一般考虑以下几个方面： 2.1.1 引物长度 PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，最佳为20～24bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq?DNA聚合酶进行反应。 2.1. 2 引物碱基构成 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。两个引物中（g+c）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（g+c）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳，过高或过低都不利于引发反应。Tm值是一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸互补双链解链的温度。Tm=4（G+C）+2（A+T）。 两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增目标DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。 2.1. 3 引物二级结构 引物应避免内部形成明显的二级结构，尤其是发夹结构。引物自身形成的二级结构包括二聚体、发卡结构、引物间二聚体等，会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。特别是在引物的3’末端，尽量避免出现这些二级结构。 2.1.4 引物3’端序列? DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以，引物3’端5～6个碱基与目标DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。正、反向引物互相不能互补，尤其是在3’末端，否则容易形成引物二聚体。 ?引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G值较低（绝对值不超过9），负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 ? ?如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。应当避免在引物的3’端使用碱基A，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基。 2.1.5 引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。 2.1.6 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。 2.2 DNA聚合酶 Taq?DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水栖高温菌（Thermus?aquaticus）中分离的，由分子量为109000的一条多肽链构成。dna聚合酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3’末端。二是有3’→5’外切酶活力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是5’→3’外切酶活力，它能从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。在体外实验中，Taq?DNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。 ?Taq?DNA聚合酶具有以下特点： （1）耐高温，在70℃下反应2小时后其残