常用分子生物学试剂的选择-中文合编.ppt

常用分子生物学试剂的选择 赵秋伟 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶的基本特性 星号活性 在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*。 必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件。 DNA连接酶 * 用于核酸操作的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶 如何选择最合适的限制性内切酶 限制性核酸内切酶的生物功能 影响限制性核酸内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的生物功能 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 细菌的限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点 异源三聚体 多功能 同源二聚体 异源二聚体 距识别序列1kb处 随机性切割 旋转对称序列 TGAN8TGCT AACN6GTGC 距识别序列下游 24-26bp处 识别序列内或附近 特异性切割 GAGCC 限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶 单功能 双功能 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 限制性核酸内切酶的命名 限制性核酸内切酶 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 H i n d III 同一菌株中含多个不同的限制性核酸内切酶,表示在该菌株中发现这种酶的先后次序。 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 5’ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3’ … C G A C T T A A G C T C … 5’ EcoRI等产生的5’粘性末端 5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoRI 37 ℃ 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’ 5’ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ OH P OH P 退火 4-7 ℃ PstI等产生的3’粘性末端 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 5’ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 37 ℃ 退火 4-7 ℃ OH P OH P PvuII等产生的平头末端 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ PvuII 37 ℃ 5’ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’ 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间 措施： DNA样品的甲基化程度： 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘C