5.2多聚酶链式反应扩增DNA课题.pptVIP

温故知新1: 1:组成DNA分子的基本单位是什么? 2:这些基本单位是如何连接成DNA分子的? 3:DNA分子结构有什么特点？ 1、 PCR（多聚酶链式反应）技术： 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 * * 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 A G C T 腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 1、基本组成单位：脱氧核苷酸 2、脱氧核苷酸链 连 接 A T G C A T G C G C 3、结构特点： 脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧构成基本骨架； 碱基排在内侧 碱基通过氢键连接成碱基对 严格遵循碱基互补配对原则： 即 A＝T配对、G≡C配对 两条链反向平行盘旋成双螺旋结构 1:DNA分子的复制过程是怎样的？ 2:DNA分子的复制需要哪些条件？ 温故知新2 第一代 第二代 第三代 第四代 ＤＮＡ半保留复制 1、DNA母链：提供复制的模板 2、解旋酶：打开DNA双链 3、4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 4、DNA聚合酶：催化合成DNA子链 5、引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始 连接脱氧核苷酸(一小段RNA) DNA复制的条件 DNA聚合酶的特性 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 DNA聚合酶只能从引物的3’端延伸DNA链。 一、基础知识 （一）PCR原理 2、PCR原理 利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 ①DNA母链：提供复制的模板 ②解旋酶： 打开DNA双链 ③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 ④ DNA聚合酶： 催化合成DNA子链 ⑤引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连 接脱氧核苷酸(一小段RNA) 3、PCR反应的条件 ②80-100℃： ④耐热的DNA聚合酶： ⑥缓冲溶液：维持反应的pH值不变 (一小段DNA或RNA) (二)PCR反应的过程 1、变性： 温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。 2、复性（退火）： 温度下降到50℃左右，两种引物与模板DNA单链结合。 3、延伸： 温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。 PCR 循环第一步： 加热变性:双链DNA解聚成为单链 模板序列 模板序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：复性（退火）: 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 模板序列 模板序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ： 延伸:合成新的DNA链 模板序列 模板序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。 第一轮结果 1 2 3 4 1 2 3 4 第二轮结果 第一轮结果 1 2 3 4 1 2 3 4 第二轮结果 二、 实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器。 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。 *