ＤＮＡ的限制性酶切反应.docVIP

ＤＮＡ的限制性酶切反应 实验目的 学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。 实验原理 核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行，但后期的筛选工作较复杂，所以要有很好的方法区分转化子中的重组子。需要注意以下几点： １．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染。注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端。内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－３u酶短时间为宜。内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；使用时防止操作中对内切酶的污染。 ２．ＤＮＡ： 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。 ３．反应缓冲液： 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间。不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。 ４．酶解温度与时间： 大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应。反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：DNA=（2-3）：1。反应2小时即可充分酶解。 实验仪器和试剂 1.仪器 恒温水浴锅 电泳仪 电泳槽 高速离心机 凝胶成像检测仪 微量移液器 移液器吸头 Eppendorf管 2.试剂 pUC19质粒样品 λＤＮＡ 10×buffer ddH2O HindⅢ 琼脂糖 实验步骤 1.按照下表添加各种试剂于Eppendorf管中。 试剂 DNA pUC19（自制） λＤＮＡ pUC19 ddH2O 13.5 66.0 37.5 10×buffer 2.0 10.0 5.0 DNA 3.0 15.0 5.0 HindⅢ 1.5 9.0 2.5 Totle 20.0 100.0 50.0 2.将盛有pUC19的20μL混合液平均分成两份,分装到两个管中。将所有4个体系充分混匀，并分别做好标记，在３７℃培养箱中反应1h以上。 3.在培养1小时后，取出少量，与电泳载样缓冲液混合均匀，进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切反应是否彻底，剩余样品可以继续酶切。 4.待电泳观察酶切反应完全后，将剩余样品从恒温水浴锅中取出，置65℃恒