细胞工程第四章.ppt

本章主要内容： 1、核移植动物（克隆动物） 2、体外受精动物（试管动物） 本章关键问题： 1、核移植动物的培育：核移植、重组胚的激活 2、体外受精动物的培育:精子获能与卵细胞成熟培养、体外受精方法、性别控制的原理与方法 一、细胞核移植(cell nuclear transfer) 将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。 ◆细胞核移植动物：用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到扩繁种群的目的。 ◆理论基础：生物的主要遗传物质存在于细胞核中，因此克隆动物可以通过细胞核移植实现。 ◆克隆（Clone）本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一生物个体的无性繁殖群体。 ◆细胞工程的克隆是指通过无性繁殖手段获得遗传背景相同的细胞群或个体的技术。 ◆以供体核的来源不同可分为胚胎细胞核移植与体细胞核移植两种。 二、细胞核移植动物的发展历程 1、两栖类（20世纪50年代） 2、鱼类（20世纪60年代） 3、哺乳类（20世纪80年代） 1、两栖类时期 两栖类动物卵数量较多且容易获得，体积较大，操作方便，成为早期动物细胞核移植研究的材料。 1952年，美国科学家布里格斯（Briggs）和托马斯·金（T.J.King）将豹蛙进行胚胎细胞核移植，获得了一个无性繁殖的豹蛙幼体。 2、鱼类时期 1980年，中国将鲫鱼胚胎细胞移入鲤鱼去核的未受精卵中实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。表现出部分父母的性状，在生长优势、蛋白质含量上超过双亲。 3、哺乳动物类时期 1984年，丹麦科学家斯丁·维拉德森成功利用胚胎细胞克隆出一只绵羊，这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物，证明胚胎细胞具有全能性。 里程碑式的突破 1997年，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司利用高度分化的绵羊乳腺上皮细胞，通过核移植克隆了一只雌性小绵羊——多莉。这是第一个体细胞克隆动物。 我国首例“胎儿皮肤上皮细胞”克隆牛“康康” 克隆牛“欣欣”，生命源于耳细胞 第二节 细胞核移植克隆动物的技术路线 （一）供体核的获得 供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行1～5 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态。 通常采用处于G0期细胞作为核移植的供体细胞。诱导细胞脱离正常周期而进入G0期。 采用细胞松弛素B（Cytochalasin B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。 （二）受体细胞去核 1、盲吸去核法：用微细玻璃管吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。 用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率 2、功能性去核法：使用Hoechst33342与卵细胞DNA结合后，用紫外线定点照射使核功能丧失。 （三）细胞核移植 细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。 ◆前者是用微吸管吸取供体核后，直接刺破受体卵质膜，将核直接注入卵周隙，完成细胞核移植。 ◆后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中，使供体细胞与卵质膜接触，融合处理使供体核进入受体卵胞质内，形成重组胚。 （四）重组胚激活 正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而使供体核的基因从头开始进行顺序表达。 重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。 1、电激活：是可把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。 2、化学激活：常用的激活剂包括乙醇、放线菌酮、离子霉素等。 （五）重组胚培养和移植 激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。 1、体内培养：将重组胚植入同种或异种动物的输卵管中发育至囊胚或桑椹胚，然后进行胚胎移植。 2、体外培养：将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体中继续发育。 （六）体细胞核移植后代的鉴定 对于体细胞核移植培育的动物，可以从形态、性别上鉴定，还可以采用分子生物学技术鉴定。 二、胚胎细胞核移植克隆动物 哺乳动物的胚胎细胞具有全能性，理论上每个胚胎细胞经过核移植，都能发育成遗传性状完全相同的个体。将胚胎细胞分离，体外培养获得胚胎干细胞系，再经过胚胎干细胞核移植可培育更多的动物个体。 三、体细胞核移植克隆动物 将动