蛋白质分离纯化技术实验讲义.docVIP

实验一 蛋白质含量分析（Bradford检测法） 实验目的 制作蛋白质浓度标准曲线； 测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。 实验原理 Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。 Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。 试剂与器材 1、试剂： 1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。 2、器材： 滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。 实验方法 考马斯亮蓝G-250染料的配置 称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5