浙江大学细胞培养-基本技术.pptVIP

细胞培养基本技术 培养技术 细胞系的建立和鉴定 培养物的固定、染色 显微镜观察 1.1 细胞的原代培养 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。 幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 意义 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。 利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学方面）效果很好。 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。 掌握无菌操作技术 了解小鼠解剖操作技术 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 了解培养细胞的消化分散 了解倒置显微镜的使用 实验材料 实验动物：孕鼠或新生小鼠 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养 瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯 原代细胞培养方法 胰酶消化法 组织块直接培养法 操作步骤1 --- 取材 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。 把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 操作步骤2 ---切割 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1 mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。 胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40 min，每隔5 min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 加入3-5 ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 静置5-10 min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 1000 rpm，离心5-10 min，弃上清液。 加入平衡盐溶液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 加入细胞生长液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37 ℃下培养。 胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养 也可将此步骤简化为： 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40 min，每隔5 min振荡一次。 静置，吸去上清，用细胞生长液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×105/ml左右），37 ℃下培养。 （注意：省略了离心、计数等步骤） 组织块直接培养法操作步骤 组织块接种： 将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。 翻转瓶底朝上，将细胞生长液加至瓶中，培养液勿接触组织块。 37 ℃静置3-5 h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入细胞生长液中（勿使组织漂起），37 ℃继续培养。 原代细胞培养结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，5-7 d即可形成单层 1.2 传代细胞培养 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3-6次 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或1:3以上的比率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养。 也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1. 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2. 半悬浮生长细胞传代（HeLa细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3. 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。 消化法传代培养步骤 传代细胞培养结果 一般情况，传代