第三章 大肠杆菌基因工程-1.ppt

P 乳糖启动子Plac O P O 高效转录 阻遏蛋白 诱导 乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 基底水平转录 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控 P 乳糖启动子Plac O P O 高效转录 阻遏蛋白 诱导 乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 高水平转录 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控 P 乳糖启动子Plac O 高效转录 阻遏蛋白 诱导 乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控 lacI 负调控 问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏） Plac -lacI 调控模式的问题与策略 Plac CAP正调控 O Plac O 高效转录 葡萄糖代谢 野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活蛋白（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 基底水平转录 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 可采用突变手段构建抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型， 即Plac UV5 CAP cAMP cAMP浓度降低 Plac UV5 O 高效转录 突变型乳糖启动子Plac UV5 问题2 乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作为诱导剂 对策 采用“安慰诱导剂”IPTG（不被降解和代谢） Plac -lacI 调控模式的问题与策略 IPTG：异丙基 D-硫代半乳糖苷 (isopropyl-β-D- thio galactoside) 问题3： 宿主lacI 阻遏蛋白表达量不高，无法满足多拷贝质粒的需求， 导致较高的本底表达（即无诱导表达） 对策 A、采用能过量表达 lacI 阻遏蛋白的 lacI q ? 突变菌株 B、在 载体上引入 lacI q ? 基因 Plac -lacI 调控模式的问题与策略 启动子 Ptrp 色氨酸启动子（Ptrp） Otrp 除去色氨酸 色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 基底水平转录 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达 色氨酸 或加3-吲哚丙烯酸 高效转录 阻遏蛋白 （IAA） Otrp Ptrp 高效转录 Otrp Ptrp 受 lacI 阻遏蛋白调控 杂合型启动子Ptac Ptac = Ptrp 的-35区 + Plac的-10区 Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac （T T G A C A） （T A T A A T） 受什么诱导？ l噬菌体启动子PL / PR 受CI阻遏蛋白阻遏 CI为组成型表达 常采用温度敏感型突变cI857 cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达 实践中，28-37℃培养， 42℃诱导。30 ℃ /37 ℃？ 发酵罐中大规模升温困难 如何解决？ 常使Ptrp控制的CI 用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达（不是加3-吲哚丙烯酸，IAA）。 Ptrp A B cI857 PL 目的基因 阻遏作用 Ptrp A B PL 表达 色氨酸 T7启动子 ——来自T7噬菌体的异源启动子 T7启动子——最成功的启动子 *只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合 酶的快 5 倍 *由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。 T7启动子调控模式 IPTG诱导T7RNA聚合酶表达 噬菌体 DE3 （ lambda 噬菌体的衍生株）含有